304 rozsdamentes acél tekercscső kémiai komponense, A SPACA6 ektodomén szerkezete az ivarsejtek fúziójához kapcsolódó fehérjék konzervált szupercsaládját tartalmazza.

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Olyan böngészőverziót használ, amely korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Ezenkívül a folyamatos támogatás érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Diánként három cikket mutató csúszkák.Használja a vissza és a következő gombokat a diák közötti mozgáshoz, vagy a végén lévő diavezérlő gombokat az egyes diák közötti mozgáshoz.

A SPACA6 egy spermiumban expresszált felszíni fehérje, amely kritikus fontosságú az ivarsejtek fúziójához az emlősök szexuális szaporodása során.Ezen alapvető szerep ellenére a SPACA6 specifikus funkciója kevéssé ismert.Megvilágítjuk a SPACA6 extracelluláris doménjének kristályszerkezetét 2,2 Å felbontással, feltárva egy kétdoménes fehérjét, amely négyszálú kötegből és Ig-szerű β-szendvicsekből áll, amelyeket kvázi rugalmas linkerek kapcsolnak össze.Ez a szerkezet hasonlít az IZUMO1-re, egy másik ivarsejt-fúzióhoz kapcsolódó fehérjére, amely a SPACA6-ot és az IZUMO1-et alapító tagjává teszi a megtermékenyítéshez kapcsolódó fehérjék szupercsaládjának, amelyet itt IST szupercsaládnak nevezünk.Az IST szupercsaládot szerkezetileg a csavart, négy hélixből álló köteg és egy pár diszulfidhoz kapcsolódó CXXC motívum határozza meg.A humán proteom szerkezet alapú AlphaFold kutatása további fehérjetagokat azonosított e szupercsaládból;ezek közül a fehérjék közül sok részt vesz az ivarsejtek fúziójában.A SPACA6 szerkezete és kapcsolata az IST szupercsalád többi tagjával jelenti a hiányzó láncszemet az emlős ivarsejtek fúziójával kapcsolatos tudásunkban.
Minden emberi élet két különálló haploid ivarsejttel kezdődik: az apa spermájával és az anyai petesejttel.Ez a spermium egy intenzív szelekciós folyamat győztese, amelynek során spermiumok milliói haladnak át a női nemi traktuson, küzdenek le különböző akadályokon1 és kapacitáción mennek keresztül, ami fokozza motilitását és a felszíni komponensek folyamatát2,3,4.Még ha a spermium és a petesejtek egymásra találnak is, a folyamat még nem ért véget.A petesejteket cumulus sejtréteg és egy glikoprotein gát veszi körül, az úgynevezett zona pellucida, amelyen keresztül a spermiumoknak át kell jutniuk a petesejtekbe.A spermiumok felületi adhéziós molekulák és membránhoz kapcsolódó és szekretált enzimek kombinációját használják fel ezen végső akadályok leküzdésére5.Ezek a molekulák és enzimek főként a belső membránban és az akroszómális mátrixban raktározódnak, és akkor észlelhetők, amikor a spermium külső membránja lizálódik az akroszómális reakció során6.Ennek az intenzív utazásnak az utolsó lépése a spermium-tojás fúziós esemény, amelyben a két sejt membránjait egyesíti, és egyetlen diploid organizmussá válik7.Bár ez a folyamat úttörő az emberi szaporodásban, a szükséges molekuláris kölcsönhatások nem ismertek.
Az ivarsejtek megtermékenyítésén kívül két lipid kettősréteg fúziójának kémiáját is alaposan tanulmányozták.Általánosságban elmondható, hogy a membránfúzió egy energetikailag kedvezőtlen folyamat, amelyhez a fehérje katalizátornak olyan szerkezeti konformációs változáson kell keresztülmennie, amely két membránt közelebb hoz egymáshoz, megszakítva azok folytonosságát és fúziót okoz8,9.Ezeket a fehérjekatalizátorokat fuzogénként ismerik, és számtalan fúziós rendszerben találták meg őket.Szükségesek a vírusnak a gazdasejtekbe való bejutásához (pl. gp160 a HIV-1-ben, spike a koronavírusokban, hemagglutinin az influenzavírusokban)10,11,12 placenta (szincitin)13,14,15 és ivarsejtképző fúziók alsóbbrendű eukariótákban ( HAP2/GCS1 növényekben, protistákban és ízeltlábúakban) 16,17,18,19.Az emberi ivarsejtek fuzogénjeit még nem fedezték fel, bár számos fehérjéről kimutatták, hogy kritikus fontosságúak az ivarsejtek kötődése és fúziója szempontjából.A petesejtekben expresszált CD9, az egér és az emberi ivarsejtek fúziójához szükséges transzmembrán fehérje volt az első, amelyet felfedeztek 21, 22, 23.Bár pontos funkciója továbbra is tisztázatlan, az adhézióban, a tojás mikrobolyhokon lévő adhéziós gócok szerkezetében és/vagy a petesejtek felszíni fehérjéinek megfelelő lokalizációjában való szerepe valószínűnek tűnik 24,25,26.A két legjellemzőbb fehérje, amelyek kritikusak az ivarsejtek fúziójához, az IZUMO127 spermiumfehérje és a JUNO28 petesejtfehérje, és ezek kölcsönös kapcsolódása fontos lépés az ivarsejtek felismerésében és a fúzió előtti adhéziójában.A hím Izumo1 knockout egerek és a nőstény Juno knockout egerek teljesen sterilek, ezekben a modellekben a spermiumok bejutnak a perivitell térbe, de az ivarsejtek nem fuzionálnak.Hasonlóan csökkent az összefolyás, amikor az ivarsejteket anti-IZUMO1 vagy JUNO27,29 antitestekkel kezelték humán in vitro megtermékenyítési kísérletekben.
A közelmúltban felfedezték az IZUMO1-hez és a JUNO20, 30, 31, 32, 33, 34, 35-höz fenotípusosan hasonló spermiumban expresszált fehérjék újonnan felfedezett csoportját.A spermium akroszómális membránhoz kapcsolódó fehérjét 6 (SPACA6) a megtermékenyítéshez nélkülözhetetlennek azonosították egy nagyszabású egérmutagenezis vizsgálatban.A transzgén beépítése a Spaca6 génbe nem olvadó spermiumokat termel, bár ezek a spermiumok beszivárognak a perivitellin térbe36.A későbbi egereken végzett kiütési vizsgálatok megerősítették, hogy a Spaca6 szükséges az ivarsejtek fúziójához30,32.A SPACA6 szinte kizárólag a herékben expresszálódik, és lokalizációs mintázata az IZUMO1-éhoz hasonló, mégpedig a spermiumok intimájában az akroszómális reakció előtt, majd az akroszomális reakció után az egyenlítői régióba vándorol 30,32.A Spaca6 homológok különféle emlősökben és más eukariótákban30 léteznek, és az emberi ivarsejtek fúziójában betöltött jelentőségét az emberi megtermékenyítés in vitro SPACA6-val szembeni rezisztencia általi gátlása igazolta.Az IZUMO1-től és a JUNO-tól eltérően a SPACA6 szerkezetének, kölcsönhatásainak és működésének részletei tisztázatlanok maradnak.
SPACA6 szerkezeti és biokémiai vizsgálatokat végeztünk, hogy jobban megértsük az emberi spermiumok és petesejtek fúziójának alapját képező folyamatot, amely lehetővé teszi számunkra, hogy tájékozódjunk a családtervezés és a termékenységi kezelés jövőbeli fejleményeiről.A SPACA6 extracelluláris doménjének kristályszerkezete egy négy helikális köteget (4HB) és egy immunglobulinszerű (Ig-szerű) domént mutat, amelyeket kvázi rugalmas régiók kötnek össze.A korábbi tanulmányok 7, 32, 37 előrejelzései szerint a SPACA6 doménszerkezete hasonló a humán IZUMO1 doménszerkezetéhez, és a két fehérje szokatlan motívummal rendelkezik: a 4HB háromszög alakú spirális felülettel és egy pár diszulfidhoz kapcsolódó CXXC motívummal.Azt javasoljuk, hogy az IZUMO1 és SPACA6 meghatározza az ivarsejtek fúziójával kapcsolatos fehérjék nagyobb, szerkezetileg rokon szupercsaládját.A szupercsalád egyedi jellemzőit felhasználva kimerítő kutatást végeztünk az AlphaFold strukturális emberi proteom után, azonosítva a szupercsalád további tagjait, köztük több olyan tagot, amelyek részt vesznek az ivarsejtek fúziójában és/vagy megtermékenyítésében.Most úgy tűnik, hogy van egy közös szerkezeti redő és a fehérjék szupercsaládja, amely az ivarsejtek fúziójához kapcsolódik, és szerkezetünk molekuláris térképet ad az emberi ivarsejtek fúziós mechanizmusának ezen fontos aspektusáról.
A SPACA6 egy egyáteresztő transzmembrán fehérje, egy N-kapcsolt glikánnal és hat feltételezett diszulfidkötéssel (S1a és S2 ábra).Kifejeztük a humán SPACA6 extracelluláris doménjét (27-246. maradék) Drosophila S2 sejtekben, és a fehérjét nikkel-affinitás, kationcsere és méretkizárásos kromatográfia segítségével tisztítottuk (S1b ábra).A tisztított SPACA6 ektodomén nagyon stabil és homogén.A méretkizárásos kromatográfiát és sokszögű fényszórást (SEC-MALS) kombinálva végzett elemzés egy 26,2 ± 0,5 kDa számított molekulatömegű csúcsot mutatott ki (S1c ábra).Ez összhangban van a SPACA6 monomer ektodomén méretével, ami azt jelzi, hogy oligomerizáció nem történt a tisztítás során.Ezenkívül a cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia vegyes α/β szerkezetet mutatott ki, olvadáspontja 51,3 °C (S1d, e ábra).A CD-spektrumok dekonvolúciója 38,6% α-helikális és 15,8% β-szálú elemeket mutatott ki (S1d ábra).
A SPACA6 ektodomént véletlenszerű mátrixoltással38 kristályosították, ami 2,2 Å felbontású adatkészletet eredményezett (1. táblázat és S3 ábra).A fragmensalapú molekuláris szubsztitúció és az SAD fázisozási adatok bromid-expozíció kombinációját alkalmazva a szerkezet meghatározásához (1. táblázat és S4. ábra), a végső finomított modell a 27–246. maradékokból áll.A szerkezet meghatározása idején nem álltak rendelkezésre kísérleti vagy AlphaFold szerkezetek.A SPACA6 ektodomén mérete 20 Å × 20 Å × 85 Å, hét hélixből és kilenc β-szálból áll, és egy megnyúlt harmadlagos redővel rendelkezik, amelyet hat diszulfid kötés stabilizál (1a, b ábra).Az Asn243 oldallánc végén lévő gyenge elektronsűrűség azt jelzi, hogy ez a maradék N-kapcsolt glikoziláció.A szerkezet két doménből áll: egy N-terminális négy-hélix kötegből (4HB) és egy C-terminális Ig-szerű doménből, köztük egy köztes csuklórégióval (1c. ábra).
a SPACA6 extracelluláris doménjének szerkezete.A SPACA6 extracelluláris doménjének csíkdiagramja, a lánc színe N-től C-terminálisig a sötétkéktől a sötétvörösig.A diszulfidkötésekben részt vevő ciszteinek bíbor színnel vannak kiemelve.b A SPACA6 extracelluláris doménjének topológiája.Használja ugyanazt a színsémát, mint az 1a. ábrán.c SPACA6 extracelluláris domén.A 4HB, a csuklópánt és az Ig-szerű tartománydiagramok narancssárga, zöld és kék színűek.A rétegek nincsenek méretarányosan rajzolva.
A SPACA6 4HB doménje négy fő hélixet tartalmaz (1–4. hélix), amelyek spirális hélix formájában helyezkednek el (2a. ábra), felváltva antiparallel és párhuzamos kölcsönhatások között (2b. ábra).A kötegre merőlegesen egy kis további egyfordulatú csavarvonal (spirál 1′) van elhelyezve, amely egy háromszöget képez az 1. és 2. csavarvonallal. Ez a háromszög kissé deformálódott a 3. és 4. csavarok viszonylag sűrű tömítésének csavarvonalban csavart tömítésében ( 2a. ábra).
4HB N-terminális szalag diagram.b Négy hélixből álló köteg felülnézete, mindegyik hélix az N-terminálisnál sötétkék, a C-terminálisnál pedig sötétvörös színnel van kiemelve.c Felülről lefelé haladó spirálkerék diagram a 4HB-hez, minden maradékot körként ábrázolva egybetűs aminosavkóddal;csak a kerék tetején lévő négy aminosav van számozva.A nem poláris maradékokat sárgára, a poláris töltetleneket zöldre, a pozitív töltésűeket kékre, a negatív töltésűeket pirosra színezzük.d A 4HB tartomány háromszög alakú lapjai, a 4HB-kkel narancssárgával és a csuklópántokkal zölddel.Mindkét betéten rúd alakú diszulfidkötések láthatók.
A 4HB egy belső hidrofób magra koncentrálódik, amely főleg alifás és aromás maradékokból áll (2c. ábra).A mag egy diszulfidkötést tartalmaz a Cys41 és Cys55 között, amely az 1. és 2. hélixeket egy felső háromszögben köti össze (2d. ábra).Két további diszulfidkötés jött létre a Helix 1' CXXC motívuma és egy másik CXXC motívum között, amely a β-hajtű csúcsán található a csuklórégióban (2d. ábra).Egy ismeretlen funkciójú konzervatív argininmaradék (Arg37) egy üreges háromszögben található, amelyet 1′, 1 és 2 hélixek alkotnak. A Cβ, Cγ és Cδ Arg37 alifás szénatomok kölcsönhatásba lépnek a hidrofób maggal, és guanidincsoportjai ciklikusan mozognak. az 1′ és az 1. hélix között a Thr32 gerinc és az oldallánc közötti kölcsönhatások révén (S5a, b ábra).A Tyr34 benyúlik az üregbe, és két kis üreget hagy maga után, amelyeken keresztül az Arg37 kölcsönhatásba léphet az oldószerrel.
Az Ig-szerű β-szendvics domének olyan fehérjék nagy szupercsaládját jelentik, amelyekben két vagy több többszálú amfipatikus β-lemez közös jellemzője, amelyek hidrofób magon keresztül kölcsönhatásba lépnek 39. A SPACA6 C-terminális Ig-szerű doménje ugyanazt a mintát mutatja. és két rétegből áll (S6a ábra).Az 1. lap négy szálból álló β-lap (D, F, H és I szál), ahol az F, H és I szálak anti-párhuzamos elrendeződést alkotnak, az I és D szál pedig párhuzamos kölcsönhatást vesz fel.A 2. táblázat egy kis anti-párhuzamos, kétszálú béta lap (E és G szál).Belső diszulfidkötést figyeltek meg az E-lánc C-terminálisa és a H-lánc (Cys170-Cys226) közepe között (S6b. ábra).Ez a diszulfidkötés analóg az immunglobulin β-szendvics doménjében lévő diszulfidkötéssel40,41.
A négyszálú β-lemez teljes hosszában elcsavarodik, aszimmetrikus éleket képezve, amelyek alakjukban és elektrosztatikusságában különböznek egymástól.A vékonyabb él egy lapos hidrofób környezeti felület, amely kiemelkedik a SPACA6 fennmaradó egyenetlen és elektrosztatikusan változatos felületeihez képest (S6b, c ábra).A hidrofób felületet szabadon álló gerincű karbonil/amino-csoportok és poláris oldalláncok halogénje veszi körül (S6c ábra).A szélesebb határt egy lezárt spirális szegmens fedi, amely blokkolja a hidrofób mag N-terminális részét, és három hidrogénkötést képez az F lánc gerincének nyitott poláris csoportjával (S6d ábra).Ennek az élnek a C-terminális része egy nagy zsebet képez, részben szabaddá tett hidrofób maggal.A zsebet pozitív töltések veszik körül, három kettős arginincsoport (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 és Arg212-Arg214) és egy központi hisztidin (His220) miatt (S6e ábra).
A csuklórégió egy rövid szegmens a spirális domén és az Ig-szerű domén között, amely egy antiparallel háromszálú β-rétegből (A, B és C szálak), egy kis 310-es hélixből és több hosszú véletlenszerű spirális szegmensből áll.(S7. ábra).Úgy tűnik, hogy a csuklórégióban kovalens és elektrosztatikus érintkezők hálózata stabilizálja a 4HB és az Ig-szerű domén közötti orientációt.A hálózat három részre osztható.Az első rész két CXXC motívumot tartalmaz (27CXXC30 és 139CXXC142), amelyek egy pár diszulfidkötést alkotnak a csuklópánt β-hajtűje és a 4HB 1′-es hélixe között.A második rész elektrosztatikus kölcsönhatásokat tartalmaz az Ig-szerű domén és a csukló között.A csuklópántban lévő Glu132 sóhidat képez az Arg233-mal az Ig-szerű doménben és az Arg135-tel a csuklópántban.A harmadik rész kovalens kötést tartalmaz az Ig-szerű domén és a csuklórégió között.Két diszulfid kötés (Cys124-Cys147 és Cys128-Cys153) összeköti a csuklóhurkot egy linkerrel, amelyet a Gln131 és a gerinc funkcionális csoportja közötti elektrosztatikus kölcsönhatások stabilizálnak, lehetővé téve a hozzáférést az első Ig-szerű doménhez.lánc.
A SPACA6 ektodomén szerkezetét, valamint a 4HB és Ig-szerű domének egyedi struktúráit használták fel szerkezetileg hasonló rekordok keresésére fehérjeadatbázisokban 42 .Azonosítottuk a magas Dali Z-pontszámú, kis szórással és nagy LALI-pontszámmal rendelkező egyezéseket (utóbbi a szerkezetileg egyenértékű maradékok száma).Míg a teljes ektodomén keresés első 10 találatának (S1 táblázat) elfogadható Z-pontszáma >842 volt, a 4HB vagy Ig-szerű tartomány keresése önmagában azt mutatta, hogy ezeknek a találatoknak a többsége csak β-szendvicseknek felelt meg.sok fehérjében megtalálható mindenütt előforduló redő.Mindhárom keresés Daliban csak egy eredményt adott: IZUMO1.
Régóta feltételezték, hogy a SPACA6 és az IZUMO1 szerkezeti hasonlóságokat mutat 7, 32, 37.Noha e két ivarsejt-fúzióval kapcsolatos fehérje ektodoménje csak 21%-os szekvenciaazonosságot mutat (S8a ábra), összetett bizonyítékok, beleértve a konzervált diszulfidkötés-mintázatot és a SPACA6-ban előrejelzett C-terminális Ig-szerű domént, lehetővé tették a korai kísérleteket egy A homológ modell egy SPACA6 egér IZUMO1-et sablonként használva37.Szerkezetünk megerősíti ezeket az előrejelzéseket, és megmutatja a hasonlóság valódi fokát.Valójában a SPACA6 és IZUMO137, 43, 44 struktúrák ugyanazt a két tartományból álló architektúrát (S8b ábra) osztják, hasonló 4HB és Ig-szerű β-szendvics tartományokkal, amelyeket egy csuklórégió köt össze (S8c ábra).
Az IZUMO1 és SPACA6 4HB közös különbségeket mutat a hagyományos spirálkötegekhez képest.A tipikus 4HB-k, mint az endoszomális fúzióban részt vevő SNARE fehérjekomplexek 45, 46, egyenletesen elhelyezkedő hélixekkel rendelkeznek, amelyek állandó görbületet tartanak fenn a központi tengely körül 47. Ezzel szemben mind az IZUMO1, mind a SPACA6 helikális doménje torzult, változó görbülettel és egyenetlen csomagolás (S8d ábra).A csavarodás, amelyet valószínűleg az 1′, 1 és 2 hélixek alkotta háromszög okoz, megmarad az IZUMO1-ben és SPACA6-ban, és ugyanaz a CXXC motívum stabilizálja az 1′ hélixen.Azonban a SPACA6-ban található további diszulfidkötés (a fenti 1. és 2. hélixet kovalensen összekötő Cys41 és Cys55) élesebb csúcsot hoz létre a háromszög csúcsán, így a SPACA6 csavartabb, mint az IZUMO1, kifejezettebb üreges háromszögekkel.Ezenkívül az IZUMO1-ből hiányzik az Arg37, amelyet a SPACA6 üregének közepén figyeltek meg.Ezzel szemben az IZUMO1-nek jellemzőbb alifás és aromás maradékokból álló hidrofób magja van.
Az IZUMO1-nek van egy Ig-szerű doménje, amely egy kétszálú és egy ötszálú β-lemezből áll43.Az IZUMO1 extra szála helyettesíti a SPACA6 tekercset, amely kölcsönhatásba lép az F szállal, hogy korlátozza a gerinc hidrogénkötéseit a szálban.Érdekes összehasonlítási pont a két fehérje Ig-szerű doménjének várható felszíni töltése.Az IZUMO1 felület negatív töltésű, mint a SPACA6 felület.A spermiummembrán felé néző C-terminális közelében egy további töltés található.A SPACA6-ban ugyanazok a régiók voltak semlegesebbek vagy pozitív töltésűek (S8e ábra).Például a SPACA6 hidrofób felülete (vékonyabb élei) és pozitív töltésű mélyedései (szélesebb élei) negatív töltésűek az IZUMO1-ben.
Bár az IZUMO1 és a SPACA6 közötti kapcsolat és másodlagos szerkezeti elemek jól megőrződnek, az Ig-szerű domének szerkezeti összehangolása azt mutatta, hogy a két tartomány általános orientációjában különbözik egymáshoz képest (S9. ábra).Az IZUMO1 spirálkötege a β-szendvics körül ívelt, így a korábban leírt „bumeráng” alakzat a központi tengelyhez képest körülbelül 50°-ban jön létre.Ezzel szemben a SPACA6 spirális gerendája körülbelül 10 ° -kal az ellenkező irányba dőlt.Az ezekben az orientációkban mutatkozó különbségek valószínűleg a csuklópánt régiójában fennálló különbségekből adódnak.Az elsődleges szekvencia szintjén az IZUMO1 és a SPACA6 csekély szekvenciahasonlóságot mutat a csuklónál, kivéve a cisztein, glicin és aszparaginsav maradékait.Ennek eredményeként a hidrogénkötések és az elektrosztatikus hálózatok teljesen mások.A β-lemez másodlagos szerkezeti elemeket az IZUMO1 és a SPACA6 osztja meg, bár az IZUMO1 láncai sokkal hosszabbak, és a 310 hélix (5. hélix) egyedülálló a SPACA6 számára.Ezek a különbségek eltérő doménorientációt eredményeznek két egyébként hasonló fehérje esetében.
A Dali szerveren végzett keresésünk feltárta, hogy a SPACA6 és az IZUMO1 az egyetlen két kísérletileg meghatározott struktúra, amely a fehérjeadatbázisban tárolódik, és amely rendelkezik ezzel a bizonyos 4HB-szeresével (S1 táblázat).A közelmúltban a DeepMind (Alphabet/Google) kifejlesztett egy neurális hálózat alapú rendszert, az AlphaFoldot, amely az elsődleges szekvenciákból képes pontosan megjósolni a fehérjék 3D-s szerkezetét48.Röviddel azután, hogy megoldottuk a SPACA6 szerkezetét, megjelent az AlphaFold adatbázis, amely prediktív szerkezeti modelleket tartalmaz, amelyek lefedik az emberi proteomban található összes fehérje 98,5%-át48,49.Feloldott SPACA6 struktúránkat keresési modellként használva az AlphaFold humán proteomban a modell strukturális homológia keresése azonosította azokat a jelölteket, amelyek szerkezeti hasonlóságai lehetnek a SPACA6-hoz és az IZUMO1-hez.Tekintettel az AlphaFold hihetetlen pontosságára a SPACA6 előrejelzésében (S10a ábra) – különösen az 1,1 Å effektív ektodomént a mi megoldott struktúránkhoz képest (S10b ábra) – biztosak lehetünk abban, hogy az azonosított SPACA6 egyezések valószínűleg pontosak.
Korábban a PSI-BLAST az IZUMO1 klasztert három másik, spermiumhoz kapcsolódó fehérjével kereste: IZUMO2, IZUMO3 és IZUMO450.AlphaFold azt jósolta, hogy ezek az IZUMO család fehérjék a 4HB doménbe hajtódnak be ugyanazzal a diszulfidkötési mintával, mint az IZUMO1 (3a és S11 ábra), bár hiányzik belőlük az Ig-szerű domén.Feltételezhető, hogy az IZUMO2 és IZUMO3 az IZUMO1-hez hasonló egyoldalú membránfehérjék, míg úgy tűnik, hogy az IZUMO4 szekretálódik.Az IZUMO 2, 3 és 4 fehérjék funkcióit az ivarsejtek fúziójában nem határozták meg.Az IZUMO3-ról ismert, hogy szerepet játszik az akroszóma biogenezisében a spermiumfejlődés során51, és azt találták, hogy az IZUMO fehérje komplexet képez50.Az IZUMO fehérjék emlősökben, hüllőkben és kétéltűekben való konzerválása azt sugallja, hogy potenciális funkciójuk összhangban van más ismert ivarsejt-fúzióval kapcsolatos fehérjékével, mint például a DCST1/2, SOF1 és FIMP.
Az IST szupercsalád tartományarchitektúrájának diagramja, narancssárga, zöld és kék színnel kiemelve a 4HB, a csuklós és az Ig-szerű doméneket.Az IZUMO4 egyedi C-terminális régióval rendelkezik, amely feketének néz ki.A megerősített és a feltételezett diszulfidkötéseket folyamatos, illetve szaggatott vonal jelzi.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F9) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) ugyanabban a színtartományban jelennek meg, mint az A panel. A diszulfid kötések bíbor színnel jelennek meg.A TMEM95, IZUMO2 és IZUMO3 transzmembrán hélixek nem láthatók.
Az IZUMO fehérjével ellentétben más SPACA fehérjékről (pl. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 és SPACA9) azt gondolják, hogy szerkezetileg különböznek a SPACA6-tól (S12. ábra).Csak a SPACA9 rendelkezik 4HB-vel, de várhatóan nem lesz ugyanolyan párhuzamos-anti-párhuzamos orientációja vagy ugyanolyan diszulfidkötése, mint a SPACA6-nak.Csak a SPACA1 rendelkezik hasonló Ig-szerű doménnel.Az AlphaFold előrejelzése szerint a SPACA3, SPACA4 és SPACA5 teljesen más szerkezetű, mint a SPACA6.Érdekes módon a SPACA4 is köztudottan szerepet játszik a megtermékenyítésben, de nagyobb mértékben, mint a SPACA6, ehelyett elősegíti a spermium és a petesejt zona pellucida közötti kölcsönhatást52.
AlphaFold keresésünk újabb találatot talált a következőre: IZUMO1 és SPACA6 4HB, TMEM95.A TMEM95, egyetlen spermaspecifikus transzmembrán fehérje, abláció után terméketlenné teszi a hím egereket 32,33.A TMEM95-öt nem tartalmazó spermiumok morfológiája, mozgékonysága normális volt, és képes volt behatolni a zona pellucidán, és kötődni a tojásmembránhoz, de nem tudtak egyesülni a petesejtek membránjával.Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a TMEM95 szerkezeti hasonlóságokat mutat az IZUMO133-mal.Valójában az AlphaFold modell megerősítette, hogy a TMEM95 egy 4HB, ugyanazzal a CXXC motívumpárral, mint az IZUMO1 és a SPACA6, és ugyanaz a további diszulfidkötés a SPACA6 1. és 2. hélixei között (3a. és S11. ábra).Bár a TMEM95-ből hiányzik az Ig-szerű domén, a SPACA6 és IZUMO1 csuklórégiókhoz hasonló diszulfidkötés-mintázatú régiója van (3b. ábra).A kézirat közzétételekor a nyomtatás előtti szerver jelentette a TMEM95 szerkezetét, megerősítve az AlphaFold53 eredményt.A TMEM95 nagyon hasonló a SPACA6-hoz és az IZUMO1-hez, és evolúciósan konzervált már a kétéltűeknél (4. és S13. ábra).
A PSI-BLAST keresés az NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP és SOF1 adatbázisokat használta ezeknek a szekvenciáknak az életfán ​​elfoglalt helyzetének meghatározására.Az elágazási pontok közötti távolságok nem méretarányosan jelennek meg.
A SPACA6 és az IZUMO1 közötti feltűnő általános szerkezeti hasonlóság arra utal, hogy alapító tagjai egy konzervált strukturális szupercsaládnak, amely magában foglalja a TMEM95 és IZUMO 2, 3 és 4 fehérjéket.ismert tagok: IZUMO1, SPACA6 és TMEM95.Mivel csak néhány tag rendelkezik Ig-szerű doménnel, az IST szupercsalád ismertetőjele a 4HB domén, amely egyedi jellemzőkkel rendelkezik, amelyek mindegyik fehérjére jellemző: 1) Összetekeredett 4HB anti-párhuzamos/párhuzamos váltakozású hélixekkel (1. ábra). 5a), 2) a köteg háromszög alakú felülettel rendelkezik, amely a kötegen belül két hélixből és egy harmadik függőleges hélixből áll (ábra kulcsterület (5c. ábra). A tioredoxinszerű fehérjékben található CXXC motívumról ismert, hogy működik redox szenzorként 54, 55, 56 , míg az IST családtagokban a motívum a protein-diszulfid izomerázokhoz, például az ERp57-hez köthető az ivarsejtek fúziójában.
Az IST szupercsalád tagjait a 4HB domén három jellegzetes vonása határozza meg: négy párhuzamos és antiparallel orientációt váltakozó hélix, ba-háromszög alakú spirális kötegfelületek és a kis molekulák között kialakuló kb. CXXC kettős motívum.) N-terminális hélixek (narancssárga) és csuklórégió β-hajtű (zöld).
Tekintettel a SPACA6 és az IZUMO1 közötti hasonlóságra, az előbbi IZUMO1-hez vagy JUNO-hoz való kötődési képességét tesztelték.A bioréteg interferometria (BLI) egy kinetikai alapú kötési módszer, amelyet korábban az IZUMO1 és a JUNO közötti kölcsönhatás számszerűsítésére használtak.A biotinnal jelölt szenzor inkubálása után IZUMO1-el, mint csaliként magas koncentrációjú JUNO analitot, erős jelet észleltünk (S14a ábra), ami a kötődés által kiváltott változást jelez az érzékelő hegyéhez rögzített bioanyag vastagságában.Hasonló jelek (azaz az érzékelőhöz csatolt JUNO csaliként az IZUMO1 analit ellen) (S14b ábra).Nem észleltünk jelet, amikor SPACA6-ot használták analitként az érzékelőhöz kötött IZUMO1 vagy az érzékelőhöz kötött JUNO ellen (S14a, b ábra).Ennek a jelnek a hiánya azt jelzi, hogy a SPACA6 extracelluláris doménje nem lép kölcsönhatásba az IZUMO1 vagy a JUNO extracelluláris doménjével.
Mivel a BLI-teszt a csalifehérjén lévő szabad lizin-maradékok biotinilációján alapul, ez a módosítás megakadályozhatja a kötődést, ha a kölcsönhatásban lizinmaradékok vesznek részt.Ezen túlmenően a kötődés szenzorhoz viszonyított orientációja sztérikus akadályokat okozhat, ezért a rekombináns SPACA6, IZUMO1 és JUNO ektodoméneken is elvégezték a hagyományos pull-down vizsgálatokat.Ennek ellenére a SPACA6 nem csapódott ki His-címkézett IZUMO1-gyel vagy His-címkézett JUNO-val (S14c, d ábra), ami azt jelzi, hogy nincs kölcsönhatás, amely összhangban van a BLI-kísérletekben megfigyeltekkel.Pozitív kontrollként megerősítettük a JUNO és a jelzett His IZUMO1 kölcsönhatását (S14e és S15 ábra).
A SPACA6 és az IZUMO1 szerkezeti hasonlósága ellenére, hogy a SPACA6 nem képes megkötni a JUNO-t, nem meglepő.Az emberi IZUMO1 felületén több mint 20 olyan maradvány található, amelyek kölcsönhatásba lépnek a JUNO-val, beleértve a három régió mindegyikéből származó maradékokat (bár legtöbbjük a csuklórégióban található) (S14f ábra).Ezek közül a maradékok közül csak egy konzervált a SPACA6-ban (Glu70).Míg sok maradék szubsztitúció megőrizte eredeti biokémiai tulajdonságait, az IZUMO1-ben az esszenciális Arg160-maradékot a SPACA6-ban negatív töltésű Asp148 váltotta fel;korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az IZUMO1 Arg160Glu mutációja szinte teljesen megszünteti a JUNO43-hoz való kötődést.Ezenkívül az IZUMO1 és a SPACA6 közötti doménorientáció különbsége jelentősen megnövelte a SPACA6 egyenértékű régiójának JUNO-kötő helyének felületét (S14g ábra).
Annak ellenére, hogy az ivarsejtek fúziójához ismert SPACA6-ra van szükség, és hasonló az IZUMO1-hez, úgy tűnik, hogy a SPACA6-nak nincs egyenértékű JUNO-kötő funkciója.Ezért igyekeztünk egyesíteni szerkezeti adatainkat az evolúcióbiológia fontosságára vonatkozó bizonyítékokkal.A SPACA6 homológok szekvencia-illesztése a közös szerkezet emlősökön túli konzerválását mutatja.Például cisztein-maradékok még távoli rokon kétéltűekben is jelen vannak (6a. ábra).A ConSurf szerver segítségével 66 szekvencia többszörös szekvencia-illesztési megtartási adatait képezték le a SPACA6 felületre.Az ilyen típusú analízis megmutathatja, hogy mely aminosavak konzerváltak meg a fehérjeevolúció során, és jelezheti, hogy mely felületi régiók játszanak szerepet a működésben.
a CLUSTAL OMEGA felhasználásával előállított 12 különböző faj SPACA6 ektodoménjeinek szekvencia-illesztése.A ConSurf elemzése szerint a legkonzervatívabb pozíciókat kékkel jelöltük.A cisztein-maradékok pirossal vannak kiemelve.A tartományhatárok és a másodlagos szerkezeti elemek az igazítás tetején láthatók, ahol a nyilak a β-szálakat, a hullámok pedig a hélixeket jelzik.A szekvenciákat tartalmazó NCBI hozzáférési azonosítók a következők: ember (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucinus majom (Cebus mimic, XP_017359366), ló (Equus caballus), ló (Equus caballus), 06 w00123 killer XP_032_034) .), birka (Ovis aries, XP_014955560), elefánt (Loxodonta africana, XP_010585293), kutya (Canis lupus familyis, XP_025277208), egér (Mus musculus, NP_001156381, NP_001156381, XPi_0 XParco1 harris ), kacsacsőrű, 8) , 61_89 és Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).A számozás emberi sorrend alapján történik.b A SPACA6 struktúra felületi ábrázolása felül 4HB-vel, alul pedig Ig-szerű tartomány, a színek a ConSurf szervertől származó megőrzési becslések alapján.A legjobban megőrzött részek kék, a közepesen megőrzött részek fehér, a legkevésbé megőrzött részek sárgák.lila cisztein.Három magas szintű védelmet mutató felületi folt látható az 1., 2. és 3. jelű foltokban. A jobb felső sarokban egy 4HB rajzfilm látható (ugyanaz a színséma).
A SPACA6 szerkezetnek három erősen konzervált felszíni régiója van (6b. ábra).Az 1. folt átfogja a 4HB-t és a csuklórégiót, és két konzervált CXXC diszulfidhidat, egy Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 csuklóhálózatot (S7. ábra) és három konzervált külső aromás maradékot (Phe31, Tyr73, Phe137) tartalmaz.az Ig-szerű domén szélesebb pereme (S6e. ábra), amely számos pozitív töltésű maradékot képvisel a spermium felszínén.Érdekes módon ez a tapasz olyan antitest-epitópot tartalmaz, amelyről korábban kimutatták, hogy zavarja a SPACA6 30 működését.A 3. régió átfogja a csuklópántot és az Ig-szerű domén egyik oldalát;ez a régió konzervált prolinokat (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) és kifelé néző poláris/töltött maradékokat tartalmaz.Meglepő módon a 4HB felületén lévő maradékok többsége erősen variálható (6b. ábra), bár a redő a SPACA6 homológban végig konzervált (amint azt a hidrofób kötegmag konzervativizmusa jelzi), és az IST szupercsaládon túl is.
Bár ez a SPACA6 legkisebb régiója a legkevesebb kimutatható másodlagos szerkezeti elemmel, sok csuklórégió-maradvány (beleértve a 3-as régiót is) erősen konzervált a SPACA6 homológok között, ami arra utalhat, hogy a spirális köteg és a β-szendvics orientációja szerepet játszik.mint konzervatív.A kiterjedt hidrogénkötések és az elektrosztatikus hálózatok ellenére azonban a SPACA6 és IZUMO1 csuklórégiójában a belső rugalmasság bizonyítéka látható az IZUMO137, 43, 44 többszörös megengedett struktúráinak összehangolásában.Az egyes domének igazodása jól átfedte egymást, de a domének egymáshoz viszonyított orientációja 50° és 70° között változott a központi tengelyhez képest (S16. ábra).Az oldatban lévő SPACA6 konformációs dinamikájának megértéséhez SAXS kísérleteket végeztünk (S17a, b ábra).A SPACA6 ektodomén ab initio rekonstrukciója egy rúdkristályszerkezethez igazodott (S18. ábra), bár a Kratky-diagram bizonyos fokú rugalmasságot mutatott (S17b. ábra).Ez a konformáció ellentétben áll az IZUMO1-gyel, amelyben a kötetlen fehérje bumeráng alakot vesz fel mind a rácsban, mind az oldatban43.
A flexibilis régió konkrét azonosítása érdekében SPACA6-on hidrogén-deutériumcsere tömegspektroszkópiát (H-DXMS) végeztünk, és összehasonlítottuk az IZUMO143-on korábban kapott adatokkal (7a, b ábra).A SPACA6 egyértelműen rugalmasabb, mint az IZUMO1, ezt bizonyítja a 100 000 másodperces csere utáni magasabb deutériumcsere a szerkezetben.Mindkét szerkezetben a csuklórégió C-terminális része magas szintű kicserélődést mutat, ami valószínűleg lehetővé teszi a 4HB és az Ig-szerű domének egymáshoz viszonyított korlátozott elfordulását.Érdekes módon a SPACA6 csukló C-terminális része, amely a 147CDLPLDCP154 aminosavból áll, egy erősen konzervált 3. régió (6b. ábra), ami valószínűleg azt jelzi, hogy a tartományok közötti rugalmasság a SPACA6 evolúciósan konzervált jellemzője.A rugalmassági elemzés szerint a CD termikus olvadék adatai azt mutatták, hogy a SPACA6 (Tm = 51,2 °C) kevésbé stabil, mint az IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (S1e és S19 ábra).
a SPACA6 és b IZUMO1 H-DXMS képei.A százalékos deutériumcserét a megadott időpontokban határoztuk meg.A hidrogén-deutérium csere szintjeit szín jelzi a kéktől (10%) a vörösig (90%) terjedő gradiens skálán.A fekete dobozok nagy csereterületeket jelölnek.A kristályszerkezetben megfigyelt 4HB, csukló és Ig-szerű domén határai az elsődleges szekvencia felett láthatók.A 10 s, 1000 s és 100 000 s deutériumcsere szintjeit egy szalagdiagramon ábrázoltuk, amely a SPACA6 és IZUMO1 átlátszó molekuláris felületére került.Az 50% alatti deutériumcsere-szintű szerkezetrészek fehér színűek.Az 50%-os H-DXMS kicserélődés feletti területek színátmenetes skálán jelennek meg.
A CRISPR/Cas9 és az egérgén-knockout genetikai stratégiák alkalmazása számos olyan tényező azonosításához vezetett, amelyek fontosak a spermiumok és petesejtek kötődése és fúziója szempontjából.Az IZUMO1-JUNO és a CD9 szerkezetének jól jellemzett kölcsönhatásától eltekintve a legtöbb ivarsejt-fúzióhoz kapcsolódó fehérje szerkezetileg és funkcionálisan rejtélyes marad.A SPACA6 biofizikai és szerkezeti jellemzése a megtermékenyítés alatti adhéziós/fúziós molekuláris puzzle egy másik darabja.
Úgy tűnik, hogy a SPACA6 és az IST szupercsalád más tagjai erősen konzerváltak az emlősökben, valamint az egyes madarakban, hüllőkben és kétéltűekben;Valójában úgy gondolják, hogy SPACA6-ra még a zebradán 59-es megtermékenyítéséhez is szükség van. Ez az eloszlás hasonló más ismert ivarsejt-fúziós fehérjékhez, mint például a DCST134, DCST234, FIMP31 és SOF132, ami arra utal, hogy ezek a faktorok HAP2-hiányosak (szintén GCS1) fehérjék, amelyek számos protista katalitikus aktivitásáért felelősek., növények és ízeltlábúak.Megtermékenyített fúziós fehérjék 60, 61. A SPACA6 és az IZUMO1 közötti erős szerkezeti hasonlóság ellenére a fehérjék bármelyikét kódoló gének kiütése meddőséghez vezetett hím egerekben, ami azt jelzi, hogy funkcióik a gaméta fúzióban nem duplikálódnak..Tágabb értelemben a fúzió adhéziós fázisához szükséges ismert spermafehérjék egyike sem redundáns.
Továbbra is nyitott kérdés, hogy a SPACA6 (és az IST szupercsalád többi tagja) részt vesz-e az intergametikus csomópontokban, intragametikus hálózatokat alkotnak-e, hogy fontos fehérjéket toborozzanak a fúziós pontokba, vagy esetleg megfoghatatlan fuzogénként működnek-e.A HEK293T sejtekben végzett koimmunprecipitációs vizsgálatok kölcsönhatást mutattak ki a teljes hosszúságú IZUMO1 és a SPACA632 között.Rekombináns ektodoménjeink azonban nem léptek kölcsönhatásba in vitro, ami arra utal, hogy a Noda et al.mindkettő törölve volt a konstrukcióban (figyeljük meg az IZUMO1 citoplazmatikus farkát, amelyről kiderült, hogy szükségtelen a megtermékenyítéshez62).Alternatív megoldásként az IZUMO1 és/vagy SPACA6 olyan specifikus kötőkörnyezetet igényelhet, amelyet in vitro nem reprodukálunk, például fiziológiailag specifikus konformációkat vagy más (ismert vagy még fel nem fedezett) fehérjéket tartalmazó molekuláris komplexeket.Bár úgy gondolják, hogy az IZUMO1 ektodomén közvetíti a spermiumok kötődését a tojáshoz a perivitellin térben, a SPACA6 ektodomén célja nem világos.
A SPACA6 szerkezete számos konzervált felületet tár fel, amelyek részt vehetnek a fehérje-fehérje kölcsönhatásokban.A CXXC motívummal közvetlenül szomszédos csuklórégió konzervált része (fent 1. foltként jelölve) számos kifelé néző aromás maradékot tartalmaz, amelyek gyakran kapcsolódnak a biomolekulák közötti hidrofób és π-halmozódó kölcsönhatásokhoz.Az Ig-szerű domén széles oldalai (2. régió) egy pozitív töltésű barázdát képeznek erősen konzervált Arg- és His-maradékokkal, és e régió elleni antitesteket korábban az ivarsejtek fúziójának blokkolására használták30.Az antitest felismeri a 212RIRPAQLTHRGTFS225 lineáris epitópot, amely a hat arginin közül hárommal rendelkezik, és erősen konzervált His220-at.Nem világos, hogy a diszfunkció ezen specifikus maradékok vagy az egész régió elzáródása miatt következik be.Ennek a résnek a β-szendvics C-terminálisához közeli elhelyezkedése cisz-kölcsönhatásokat jelez a szomszédos spermafehérjékkel, de nem a petesejtekkel.Ezenkívül egy nagyon rugalmas prolinban gazdag gubanc (3. hely) a csuklón belül egy fehérje-fehérje kölcsönhatás helye lehet, vagy valószínűbb, hogy a rugalmasság megtartását jelezheti a két domén között.A SPACA6 ismeretlen szerepe szempontjából fontos a nem.ivarsejtek fúziója.
A SPACA6 intercelluláris adhéziós fehérjék tulajdonságaival rendelkezik, beleértve az Ig-szerű β-szendvicseket.Számos adhezív fehérje (pl. kadherinek, integrinek, adhezinek és IZUMO1) rendelkezik egy vagy több β-szendvics doménnel, amely kiterjeszti a fehérjéket a sejtmembránról a környezeti célpontjaikra63, 64, 65.A SPACA6 Ig-szerű doménje egy olyan motívumot is tartalmaz, amely általában megtalálható a tapadás és kohézió β-szendvicseiben: párhuzamos szálak kettősei a β-szendvicsek végén, amelyeket mechanikus bilincseknek neveznek66.Úgy gondolják, hogy ez a motívum növeli a nyíróerők ellenállását, ami értékes az intercelluláris kölcsönhatásokban részt vevő fehérjék számára.Az adhezinekkel való hasonlóság ellenére azonban jelenleg nincs bizonyíték arra, hogy a SPACA6 kölcsönhatásba lépne a tojásfehérjével.A SPACA6 ektodomén nem tud kötődni a JUNO-hoz, és a SPACA6-ot expresszáló HEK293T sejtek, amint az itt látható, alig lépnek kölcsönhatásba a zónát 32 hiányzó petesejtekkel.Ha a SPACA6 valóban létrehoz intergametikus kötéseket, ezek a kölcsönhatások poszttranszlációs módosításokat igényelhetnek, vagy más spermafehérjék stabilizálhatják őket.Ez utóbbi hipotézis alátámasztására az IZUMO1-hiányos spermiumok petesejtekhez kötődnek, bizonyítva, hogy az IZUMO1-től eltérő molekulák vesznek részt az ivarsejt-adhéziós lépésben27.
Számos vírusos, sejtes és fejlődési fúziós fehérje rendelkezik olyan tulajdonságokkal, amelyek előrejelzik fuzogén funkciójukat.Például a virális fúziós glikoproteinek (I., II. és III. osztály) egy hidrofób fúziós peptidet vagy hurkot tartalmaznak a fehérje végén, amelyet a gazdaszervezet membránjába inszertálnak.Az IZUMO143 hidrofilitási térképe és az IST szupercsalád (meghatározott és előrejelzett) szerkezete nem mutatott látszólagos hidrofób fúziós peptidet.Így, ha az IST szupercsalád bármely fehérje fuzogénként működik, azt más ismert példáktól eltérő módon teszi.
Összefoglalva, az ivarsejtek fúziójával kapcsolatos fehérjék IST szupercsaládjának tagjainak funkciói továbbra is kínzó rejtély marad.A jellemzett SPACA6 rekombináns molekulánk és feloldott szerkezete betekintést nyújt e közös struktúrák közötti kapcsolatokba, valamint az ivarsejtek kötődésében és fúziójában betöltött szerepükbe.
A megjósolt humán SPACA6 ektodoménnek megfelelő DNS-szekvenciát (NCBI hozzáférési szám: NP_001303901.1; 27–246. oldallánc) kodonoptimalizáltuk a Drosophila melanogaster S2 sejtekben való expresszióhoz, és a Kozakot (Eurofins Genomics) kódoló szekvenciával génfragmentumként szintetizálták., a BiP szekréciós szignál és a megfelelő 5′ és 3′ végek e gén ligálástól független klónozásához pMT expressziós vektorba, amely egy metallotionein promóteren alapul, amelyet puromicinnel (pMT-puro) szelekcióra módosítottak.A pMT-puro vektor egy trombin hasítási helyet kódol, amelyet egy 10x-His C-terminális tag követ (S2. ábra).
A SPACA6 pMT-puro vektor stabil transzfekcióját D. melanogaster S2 (Gibco) sejtekbe az IZUMO1 és JUNO43 esetében használt protokollhoz hasonlóan hajtottuk végre.Az S2 sejteket felolvasztjuk, és Schneider-féle tápközegben (Gibco) növesztjük, amelyet 10% (v/v) hővel inaktivált borjúmagzati szérummal (Gibco) és 1X gombaellenes antibiotikummal (Gibco) egészítettünk ki.A korai passzázs sejteket (3,0 x 106 sejt) 6 lyukú lemezek (Corning) egyes üregeibe szélesztettük.24 órás 27 °C-os inkubálás után a sejteket 2 mg SPACA6 pMT-puro vektor és Effectene transzfekciós reagens (Qiagen) keverékével transzfektáltuk a gyártó protokollja szerint.A transzfektált sejteket 72 órán át inkubáltuk, majd 6 mg/ml puromicinnel összegyűjtöttük.A sejteket ezután komplett Schneider-tápközegből izoláltuk, és szérummentes Insect-XPRESS táptalajba (Lonza) helyeztük a nagy léptékű fehérjetermelés érdekében.Az S2 sejttenyészet 1 literes tételét 8–10 × 106 ml-1 sejtre növesztjük egy 2 literes szellőztetett, lapos fenekű polipropilén Erlenmeyer-lombikban, majd sterilizáljuk 500 µM CuSO4 végső koncentrációval (Millipore Sigma), és sterilen szűrjük.indukált.Az indukált tenyészeteket 27 °C-on 120 fordulat/perc sebességgel inkubáltuk négy napon át.
A SPACA6-ot tartalmazó kondicionált tápközeget 5660xg-vel 4 °C-on centrifugálással izoláltuk, majd Centramate tangenciális áramlású szűrőrendszerrel (Pall Corp) 10 kDa MWCO membránnal.Vigyen fel SPACA6-ot tartalmazó koncentrált tápközeget egy 2 ml-es Ni-NTA agaróz gyanta (Qiagen) oszlopra.A Ni-NTA gyantát 10 oszloptérfogatnyi (CV) A pufferrel mostuk, majd 1 CV A pufferrel mostuk, hogy az imidazol végső koncentrációja 50 mM legyen.A SPACA6-ot 10 ml imidazollal kiegészített A pufferrel eluáltuk 500 mM végkoncentrációig.A restrikciós osztályú trombint (Millipore Sigma) közvetlenül a dialíziscsőbe (MWCO 12-14 kDa) adtuk 1 egység/mg SPACA6-val szemben 1 liter 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 és 150 mM NaCl (B puffer) a dialízishez.) 4°C-on 48 órán át.A trombinnal hasított SPACA6-ot ezután háromszorosára hígítottuk a sókoncentráció csökkentése érdekében, és egy 1 ml-es MonoS 5/50 GL kationcserélő oszlopra (Cytiva/GE) töltöttük, amelyet 10 mM Tris-HCl-dal (pH 7,5) ekvilibráltunk.A kationcserélőt 3 CV 10 mM Tris-HCl-lel (pH 7,5) mostuk, majd SPACA6-ot eluáltunk 0-500 mM NaCl 10 mM Tris-HCl-ban (pH 7,5) lineáris gradienssel 25 CV-re.Ioncserélő kromatográfia után a SPACA6-ot 1 ml-re betöményítettük, és izokratikusan eluáltuk egy ENrich SEC650 10 x 300 oszlopról (BioRad), amelyet B pufferrel ekvilibráltunk. A kromatogram szerint a SPACA6-ot tartalmazó frakciókat egyesítjük és koncentráljuk.A tisztaságot Coomassie-festett elektroforézissel ellenőriztük 16%-os SDS-poliakrilamid gélen.A fehérjekoncentrációt 280 nm-en mért abszorbancia segítségével határoztuk meg a Beer-Lambert törvény és az elméleti moláris extinkciós együttható segítségével.
A tisztított SPACA6-ot egy éjszakán át dializáltuk 10 mM nátrium-foszfáttal (pH 7,4) és 150 mM NaF-mal szemben, és 0,16 mg/ml-re hígítottuk, mielőtt CD-spektroszkópiával analizáltuk.A 185-260 nm hullámhosszú CD-lemezek spektrális pásztázását Jasco J-1500 spektropolariméterrel gyűjtöttük 1 mm-es optikai úthosszúságú kvarcküvetták (Helma) segítségével 25 °C-on, 50 nm/perc sebességgel.A CD-spektrumokat alapvonalon korrigáltuk, 10 felvételen átlagoltuk, és átlagos reziduális ellipticitásra (θMRE) konvertáltuk cm2/dmol fokban:
ahol MW az egyes minták molekulatömege Da-ban;N az aminosavak száma;θ az ellipticitás millifokban;d az optikai út hosszának felel meg cm-ben;fehérjekoncentráció egységekben.