310 10*1mm Rozsdamentes acél tekercses cső kémiai komponens, A spidroin N-terminális doménjei amiloid rostokon alapuló hidrogélt képeznek, és platformot biztosítanak a fehérje immobilizálásához.

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Olyan böngészőverziót használ, amely korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Ezenkívül a folyamatos támogatás érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Diánként három cikket mutató csúszkák.Használja a vissza és a következő gombokat a diák közötti mozgáshoz, vagy a végén lévő diavezérlő gombokat az egyes diák közötti mozgáshoz.

Leírás

310 10*1mm-es Rozsdamentes acél tekercscsövek beszállítói

Kémiai összetétel

Mechanikai tulajdonságok

A rekombináns pókselyem fehérjéknek (pókselyemfehérjéknek) számos lehetséges felhasználási területük van új bioanyagok fejlesztésében, de multimodális és aggregációra hajlamos természetük megnehezíti a beszerzésüket és a felhasználásukat.Itt beszámolunk arról, hogy a rekombináns miniatűr spidroin fehérjék és, ami fontos, maga az N-terminális domén (NT) gyorsan önhordó és átlátszó hidrogélt képez 37 °C-on.az NT-ből és zöld fluoreszcens fehérjéből vagy purin nukleozid foszforilázból álló fúziós fehérjék teljesen működőképes fúziós fehérjéket alkotnak.Hidrogélek.Eredményeink azt mutatják, hogy a rekombináns NT és fúziós fehérjék magas expressziós hozamokat biztosítanak, és vonzó tulajdonságokkal ruházzák fel a hidrogéleket, mint például az átlátszóság, a térhálósodás nélküli gélesedés és az aktív fehérjék nagy sűrűségű közvetlen immobilizálása.
A pókoknak akár hét különböző selyemmirigykészletük van, amelyek mindegyike egy bizonyos típusú selymet termel.Mind a hét selyemfaj körülbelül 6000 maradék hosszúságú pókselyem fehérjékből (spidroinokból) áll, és egy nagy központi ismétlődő régiót tartalmaz, amelyet gömb alakú N- és C-terminális domének (NT és CT) vesznek körül1,2.A legszélesebb körben tanulmányozott selyemtípust, az elsődleges ampullát az elsődleges ampullamirigy állítja elő.Ebben a mirigyben a hámsejtek egyrétegű sejtjei spidroin fehérjéket szintetizálnak, és a mirigy lumenébe választják ki, ahol oldható formában (dopping) vannak jelen rendkívül magas koncentrációban (30-50% w/v)3,4.A mirigyben található fő ampulláris spidroin fehérjék szerveződését és konformációját vitatták, de a legtöbb kísérleti bizonyíték általában spirális és/vagy véletlenszerű spirális konformáció és micelláris vagy lamellás struktúrák jelenlétét jelzi5, 6, 7, 8, 9, 10.Míg az ismétlődő domének szabályozzák a selyemszálak mechanikai tulajdonságait, β-lemez nanokristályokat és amorf struktúrákat képezve 11, 12, 13, 14, 15, a végdomének szabályozzák a selyemszálakat a selyemmirigy mentén változó körülmények hatására16, 17, 18.A selyemképződés szabályozásával 19. A terminális domének evolúciósan konzerváltak és funkciójuk az összes spidroin fehérjére jellemző 2,20,21.A mirigyen való áthaladás során a spidroin pH-ja körülbelül 7,6-ról < 5,716-ra csökken, és a fokozatosan szűkülő csatornán való mozgás által közvetített nyírással és nyújtással növekszik.Az oldatban a CT egy α-spirális konstitutív párhuzamos dimer17, de az alacsony pH-értékre és a nyíróerők hatására a CT kibontakozik és átkapcsolja a β-rétegeket16, 17, esetleg β-rétegeket vált ki a Convert 16 ismétlődő régióiban. Az NT alatt monomerek a mirigy lumenében uralkodó állapotokat tükröző és a spidroin oldhatóságát közvetítő körülmények, de csökkent pH mellett számos karbonsav oldallánc protonálódása a NT körülbelül 6,5 pKa-értékkel történő dimerizációjához vezet, ezáltal stabilizálja az NT-t és rögzíti a spidroint nagyban. mennyiségeket.hálózatok16,18.Így az NT kulcsszerepet játszik a filamentumképzésben, a bevonatban lévő monomerből dimerré változik a szálban23,24,25.Az NT nagymértékben oldható és helikális marad minden eddig vizsgált körülmény között16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, ami inspirálta kifejlesztését, mint oldhatóságot javító jelölést heterológ fehérjék előállításához.
A rekombináns mini pók selyemfehérje, amely egy NT-ből, egy rövid ismétlődő régióból, egy CT-ből és egy His6 címkéből (His-NT2RepCT) áll a tisztítás céljából, ugyanúgy oldódik vizes pufferben, mint a natív pók selyemfehérje, és utánozza a selyempók natív fontos jellemzőit. .fedezet 25.31.A His-NT2RepCT folytonos szálakká sodorható biomimetikus gép segítségével, amelyben egy pH 8-as oldható bevonatot extrudálnak 525, 32, 33, 34, 35 pH-jú vízfürdőbe.A His-NT2RepCT-t expresszáló E. coli bioreaktoros fermentációja és az azt követő utókezelés tisztítás után >14 g/l hozamot eredményezett.A His-NT2RepCT magas hozama, nagy oldhatósága és savas körülményekre adott megfelelő válaszreakciója mind az NT23, 25, 34-nek tulajdonítható.
Itt beszámolunk az átlátszó hidrogélek gyors képződéséről a rekombináns spidroin fehérjékből, beleértve az NT-t önmagában, fehérjeoldat 37 ° C-on történő inkubálásával.Tioflavin T fluoreszcenciát (ThT), Fourier transzformációs infravörös spektroszkópiát (FTIR), mágneses magrezonancia spektroszkópiát (NMR) és transzmissziós elektronmikroszkópiát (TEM) használva azt találtuk, hogy az NT és a mikropók fehérjék szerkezeti átalakuláson mennek keresztül β-lemezekké és amiloidszerű fibrillákká. amikor gélek képződnek.Ezenkívül az NT és a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) vagy a purin nukleozid foszforiláz (PNP) fúziós fehérjéi hidrogélt képeznek teljesen működőképes fúziós fragmentumokkal.A heterológ gazdaszervezetekben a nagy áteresztőképességű expresszió, fiziológiás körülmények között gyors hidrogélképződéssel párosulva, megnyitja a lehetőséget a tervezett funkciókkal rendelkező hidrogélek költséghatékony előállítására.
A legtöbb bejelentett rekombináns spidroin fehérjétől36 ellentétben a His-NT2RepCT stabil Tris-HCl pufferben pH 8-on, és csapadék nélkül 500 mg/ml-ig koncentrálható25.Ezért meglepődve tapasztaltuk, hogy ez a fehérje 37 °C-on inkubálva gyorsan optikailag tiszta, önhordó hidrogélt képez (1b-d ábra).További vizsgálatok kimutatták, hogy a His-NT2RepCT gélesedés a fehérjekoncentrációk széles tartományában (10-300 mg/ml) fordult elő, és ez a koncentráció fordítottan korrelált a gélesedési idővel (1c. ábra és 1. kiegészítő ábra).Annak érdekében, hogy megtudjuk, a His-NT2RepCT mely részei közvetítik a hidrogél képződését, az egyes doméneket külön-külön és különféle kombinációkban vizsgáltuk egy lombik inverziós vizsgálattal (1a, b ábra).A rekombináns spidroin összes vizsgált frakciója gélt képez (300 mg/ml fehérjekoncentrációnál) kevesebb mint 1 óra alatt, kivéve a kicsapódott 2Rep-et (1b. ábra).Ez arra utal, hogy az NT és a CT önmagában, kombinációban vagy ismétlődésekkel társítva gélesedhet 37 °C-on, és a His6-tag nem befolyásolja ezt a folyamatot jelentős mértékben.Tekintettel arra az elterjedt nézetre, hogy az NT egy nagyon jól oldódó és stabil fehérje, és hogy a rekombináns spidroin hidrogélekről szóló korábbi jelentések gélesedési hatást tulajdonítottak az ismétlődő régiókban és/vagy CT-kben bekövetkező konformációs változásoknak, maga az NT is képes volt rá.A gélesedés felfedezése váratlan volt.Kiegészítő táblázat 1) 37, 38, 39. Figyelemre méltó, hogy az NT már 10 percen belül gélesedik ≥ 300 mg/ml koncentrációban (1c. ábra).A különböző koncentrációjú NT-vel végzett fiola inverziós kísérletek azt mutatták, hogy >50 mg/ml-nél az NT-oldat gyorsabban gélesedik, mint a His-NT2RepCT a megfelelő koncentrációnál (w/v, 1c. ábra).
A munkában vizsgált különböző spidroin konstrukciók sematikus ábrázolása.b Gélidő 37 °C-on különböző rekombináns spidroin fehérjéknél (300 mg/ml), az injekciós üveg megfordításával igazolva.CT gél azonnal, inkubáció nélkül (<300 mg/ml), 2Rep kicsapódik (300 mg/ml, 5 mm-es skála).c His-NT2RepCT és NT gélesedési ideje a jelzett fehérjekoncentrációknál 37°C-on.d Fényképek a His-NT2RepCT és az NT hidrogélekről, amelyek alatt a pók és az „NT” betű látható (mindkettő 200 mg/ml, skála 5 mm).
A különböző rekombináns spidroin fehérjék által alkotott hidrogélek kissé eltérő színűek, és a szabad szemmel történő megfigyelés eltérő mértékű átlátszóságot mutat (1b. ábra).Az NT gélek kivételesen átlátszóak, míg a többi gél átlátszatlanná válik.A hengeres csövekbe öntött His-NT2RepCT és NT géleket sértetlenül ki lehetett venni a formából (1d. ábra).
Annak tesztelésére, hogy a természetes pókselyembevonatok gélesednek-e olyan körülmények között, amelyekről kiderült, hogy a rekombináns spidroin fehérjék gélesedését okozzák, bevonatokat gyűjtöttek a svéd hídpók (Larinioides sclopetarius) nagy ampulla mirigyéből.A bevonatokat 20 mM Tris-HCl pufferben tároltuk 50 mg/ml koncentrációban (a mért száraz tömeg alapján), de a 21 napos 37 °C-os inkubáció során nem figyeltünk meg gélesedést (2a. kiegészítő ábra).
E gélek mennyiségi meghatározásához reológiai mérések használhatók a gélesedési folyamat tanulmányozására és az általános mechanikai tulajdonságok meghatározására.Különösen a tárolási modulus (rugalmasság) megfigyelése emelt hőmérsékleten nyújthat információt a gélesedési hőmérsékletről, valamint a bevonat viszkoelasztikus tulajdonságairól.Hőmérséklet-emelkedési kísérletek (1°C/perc 25-45°C-on, természetes selyem törzsoldatokkal végzett korábbi vizsgálatok alapján)40,41 azt mutatták, hogy a His-NT2RepCT és NT oldatok tárolási modulusa a hőmérséklet emelkedésével nőtt.nőtt (2. ábra és 3. kiegészítő ábra).Nevezetesen, az NT modul alacsonyabb hőmérsékleten kezdett növekedni, mint a His-NT2RepCT, ami összhangban van a gyorsabb gélesedési idővel, amelyet akkor figyeltek meg, amikor az NT-t közvetlenül His-NT2RepCT-vel 37 °C-on inkubáltuk (1. ábra).A későbbi hőmérséklet-csökkenés után a tárolási modulus nem tért vissza alacsonyabb értékekre, és a veszteségi modulus felett maradt (lásd a 3. kiegészítő ábrát), ami termikusan visszafordíthatatlan stabil gélesedést jelez.A gélesedés után a végső rugalmassági modulus 15 és 330 kPa között volt a His-NT2RepCT hidrogélek esetében 100-500 mg/ml koncentráció mellett, és az NT hidrogélek végső rugalmassági modulusa (100-500 mg/ml) 2 és 1400 között volt. kPa (ábra , 2 és teljes rámpaadatok) lásd a 3. kiegészítő ábrát).
a Hőmérsékletváltozás a His-NT2RepCT (300 mg/ml) és b NT (300 mg/ml) rázatással végzett mérése során.A nyilak a hőmérsékleti trendet jelzik, a tárolómodul adatok világosabb árnyékolása pedig a gyártó által előírtnál alacsonyabb nyomatékértékeken történő tesztelést ábrázol, ami a megnövekedett zaj oka.c His-NT2RepCT és NT felhalmozódása a végmodulban megemelt hőmérséklet (100, 300 és 500 mg/ml) után.Minden modul leolvasása 0,1 Hz frekvencián történik.
A gélesedéssel kapcsolatos konformációs változások vizsgálatának lehetséges módszereként a His-NT2RepCT és NT FTIR spektrumát vettük fel a gélesedés előtt és után 37 °C-on (3a, b ábra).Amint az várható volt, a His-NT2RepCT és NT oldatok spektruma α-hélix/random coil másodlagos szerkezetű fehérjéknek felelt meg, 1645 cm-1-nél kifejezett sávval.Mindkét hidrogél esetében a gélesedés két kar kialakulását eredményezte a középső I sávban körülbelül 1617 cm-1 és 1695 cm-1 (3a, b ábra), ami antiparallel β-lemez szerkezetek kialakulását jelzi.Ezek a változások jól láthatóak a megfelelő második derivált és differenciálgélesedési spektrumokban is (4b. kiegészítő ábra).Az NT β-réteg két sávja kifejezettebb volt, mint a His-NT2RepCT-é, ami azt jelzi, hogy az NT hidrogélben a β-réteg sávjainak teljes tartalma magasabb volt, mint az NT2RepCT hidrogélé.
a His-NT2RepCT és a b NT FTIR abszorpciós spektruma (mindkettő 500 mg/ml) 37 °C-on történő inkubálás előtt (oldat) és után (gél).c TEM képek újraszuszpendált 50 mg/ml NT2RepCT gélekről és d NT-ről.Skála 200 nm.e His-NT2RepCT és NT hidrogélek rostátmérői.n = 100 mért fibrill, p < 0,0001.A hibasávok a szórást mutatják.A hibasávok közepe az átlag.A statisztikai elemzéshez páratlan t-próbát (kétfarkú) használtunk.f Különféle rekombináns spidroin fehérjék ThT fluoreszcenciája (100 mg/ml) 37 °C-on rázás nélkül.g NT (100 mg/ml) oltási kísérletek 100 mg/ml NT gélből 0%, 5%, 10% és 20% magvakkal.
A gél transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) végzett elemzése azt mutatta, hogy a hidrogél amiloidszerű rostokból áll (3c. és 3d. ábra).Az NT képződött fibrillák megnyúltak (5-12 nm átmérőjű) és el nem ágaztak, míg a His-NT2RepCT fibrillák rövidebbek és szignifikánsan szélesebb átmérőjűek (7-16 nm) (3e. ábra).Ezek az eredmények lehetővé tették, hogy a tioflavin T (ThT) assay segítségével kövessük a fibrózis kinetikáját.Az összes rekombináns spidroin fehérje esetében a fluoreszcens jel nőtt, amikor a mintákat 37 °C-on inkubáltuk (3f. ábra, kiegészítő 5a. ábra).Ezzel a megállapítással összhangban az NT és a His-NT2RepCT mikroszkópos vizsgálata gélesedési körülmények között egyenletes növekedést mutatott ki a ThT fluoreszcenciában a ThT-pozitív aggregátumok észrevehető helyi felhalmozódása nélkül (kiegészítő 5b, c ábra).A ThT-pozitív fibrillumok képződését nem kísérte az NT és a His-NTCT zavarosság növekedése (kiegészítő 5d. ábra), ami azt jelenti, hogy a gélben fibrillák hálózata képződhet anélkül, hogy a gél tisztaságát veszélyeztetné.Kis mennyiségű előre kialakított fibrillumok hozzáadásával történő vetés jelentősen felgyorsíthatja egyes amiloidok rostképződését42, 43,44, de 5%, 10% vagy 20% (w/w) NT hozzáadása NT hidrokoagulánsok oldatához.magoló hatás (3g. ábra).Talán ennek az az oka, hogy a hidrogélben lévő rostok viszonylag rögzítettek, és nem használhatók magként.
A rekombináns spidroin fehérjék váratlan viselkedése magas hőmérsékleten további magmágneses rezonancia (NMR) spektroszkópiai vizsgálatokra késztetett a gélképződéssel kapcsolatos konformációs változások azonosítására.A His-NT2RepCT oldatok NMR-spektrumai, amelyeket idővel 37 °C-on vettek fel, azt mutatták, hogy a CT részben még mindig fel volt hajtva, míg az NT és 2Rep jelek eltűntek (4a. ábra), ami arra utal, hogy főleg az NT és a 2Rep szabályozta részben a His- NT2RepCT hidrogél.A CT jelet is az eredeti intenzitás 20%-ára csillapították, ami arra utal, hogy a CT is többnyire rögzített és beépült a hidrogél szerkezetébe.A CT egy kisebb része esetében, amely ugyanolyan mozgékony, mint az előinkubált mintában, és így az oldat NMR-rel megfigyelhető, a spektrumokból hiányoznak a jelek az első 10 strukturált aminosavhoz, valószínűleg a His-NT2Rep csatolt részének nehéz rögzítése miatt.A hidrogélek -NT2RepCT állapotának NMR spektruma az α-hélixek és β-rétegek túlnyomó jelenlétét, és kisebb mértékben a véletlenszerű tekercs konformációját tárta fel (4b. ábra).A csak NT-ben jelenlévő metionin-maradékok kémiai eltolódás-analízise azt mutatta, hogy ez a domén β-lemez szerkezetté alakult.Az oldatban lévő NT időfüggő spektrumai a jelintenzitás egyenletes csökkenését mutatták (4c. ábra), az NT hidrogélek szilárdtest NMR-vizsgálata pedig azt mutatta, hogy az NT maradékok többsége β-lemez szerkezetté alakult (4d. ábra).A 2Rep konformációját aggregálódási hajlama miatt nem lehetett külön meghatározni.Az NTCT és a His-NT2RepCT hidrogél szilárd fázisú NMR spektruma azonban nagyon hasonlónak tűnt (4b. ábra; 6b. kiegészítő ábra), ami arra utal, hogy a 2Rep kevéssé járult hozzá a His-NT2RepCT hidrogél szerkezeti részéhez.A CT-hidrogélek esetében α-hélixeket, β-lemezeket és véletlenszerű spirális másodlagos struktúrákat találtak (kiegészítő 6d. ábra).Ez arra utal, hogy a CT egyes részei α-hélixek maradnak, míg mások β-lemezekké válnak.Így az NMR-spektroszkópia eredményei arra utalnak, hogy az NT fontos a hidrogélképződéshez, és β-lemez konformációvá alakul át a 2Rep-vel és a CT-vel való fúzió során.Ezzel összhangban nemrégiben azt találtuk, hogy amiloid térbeli cipzárak valószínűleg az NT domén mind az öt hélixében képződnek, és a Waltz algoritmus amiloidogén régiót jósolt meg az 1. hélixben (4e. ábra).
15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT oldat 2D spektrumai inkubálás előtt (kék) és 19 órával utána (piros) 37°C-on.Az egyes keresztcsúcsokat a piros spektrumban és az F24, G136, poliA kék spektrumban egybetűs aminosav-szimbólumokkal és aminosav-számokkal jelöljük.A betétek a jel intenzitásának időfüggőségét mutatják az NT, 2Rep és CT domének kiválasztott maradékainál.b His-NT2RepCT hidrogélek szilárdtest-rádiófrekvenciás (RFDR) spektrumai.Az RFDR spektrumokban megfigyelt Cα/Cβ csoportok korrelációit a modellpeptid kémiai eltolódásaival, valamint a statisztikákból82, 83 és azok másodlagos szerkezetéből származó értékekkel való összehasonlítással határoztuk meg.SSB – forgó oldalszalag.c 15N-HSQC 10 mg/ml NT-oldat egydimenziós spektruma 37 °C-on, 36 órán át végzett inkubálás közben.A betét a térfogati intenzitást mutatja az idő függvényében.d NT hidrogélek szilárdtest RFDR spektrumai.A Cα/Cβ csoportok és másodlagos szerkezeteik összefüggései az RFDR spektrumokban láthatók.e A Zipper adatbázis (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT45.79 fibrillációs hajlam profilján alapul.A hexapeptid térbeli villám-eltolódási ablakának Rosetta energiája kcal/mol-ban van feltüntetve.A piros oszlopok nagy fibrózishajlamú hexapeptideket jelölnek (Rosetta energia -23 kcal/mol alatt; a szaggatott vonal alatt).A zöld sávok a küszöb feletti Rosetta-energiájú töredékeket jelzik, és ezért kevésbé valószínű, hogy sztérikus cipzárt képeznek.A prolint tartalmazó fragmenseket kizártuk az elemzésből (oszlopok nélkül).A négyzetek a Waltz algoritmus81 (https://waltz.switchlab.org) által előre jelzett amiloidózis területeit jelzik.Az NT aminosavainak szekvenciája felül van, és a β másodlagos szerkezetében található csoportok típusai (szilárd fázisú NMR spektroszkópiával meghatározva) piros színnel láthatók.Az öt NT α-hélix helyzetét (H1-H5)28-nak jelöljük.
A pH <6,5-nél a HT dimerizálódik, ellenáll a hő- vagy karbamid-indukált denaturációnak18.Annak tisztázására, hogy az NT dimerizációja és stabilitása hogyan befolyásolja a gélesedést, a 100 mg/ml NT-t tartalmazó oldatokat 8, 7 és 6 pH-értékre kontrolláltuk fiola inverziós teszttel.A pH 8 és 7 mellett inkubált NT minták 30 perc elteltével 37 °C-on gélesedtek, de a pH 8-as gél tiszta maradt, míg a pH 7-es gél látható csapadékot mutatott (5a. ábra).Ezzel szemben a 6-os pH-jú HT-t tartalmazó oldat nem képez gélt, és 37 °C-on 20 perc elteltével nagy csapadék látható.Ez arra utal, hogy maguk a dimerek és/vagy a monomerekhez képest nagyobb stabilitásuk megakadályozza a gélesedést.7-es és 6-os pH-értéken nem várható NT-csapadék képződése, mivel a jelentések szerint az NT 200 mg/ml27-nél oldódik, hődenaturáció után könnyen visszahajt, és alacsonyabb α-hélixet is megtart. pH 18. Ezen eltérések valószínű magyarázata az, hogy a korábban közölt kísérleteket szobahőmérsékleten vagy az alatt, illetve viszonylag alacsony fehérjekoncentráció mellett végezték16,18,19.
NT fiola inverziós teszt (100 mg/ml) pH 8, 7, 6 és 154 mM NaCl (pH 8) mellett 37°C-on történő inkubálás után.b NT CD spektrumok 154 mM NaF és 154 mM NaCl mellett, illetve anélkül.A 222 nm-nél mért moláris ellipticitást a természetes redők arányára alakítjuk át.c NT inverziós vizsgálat (100 mg/ml) NT* (37 °C és 60 °C), NTA72R (37 °C) és His-NT-L6 (37 °C és 60 °C).d Az NT*, NTA72R és His-NT-L6 NT mutánsok CD-spektrumai.A 222 nm-nél mért moláris ellipticitást a természetes redők arányára alakítjuk át.e NTFlSp, NTMiSp és redukált NTMiSp (100 mg/ml) inverziós tesztje.Skála 5 mm.f NT, NTFlSp, NTMiSp és redukált NTMiSp CD spektrumai.A 222 nm-nél mért moláris ellipticitást a természetes redők arányára alakítjuk át.A teljes NT-spektrumok 25 °C-on és 95 °C-on a 8. kiegészítő ábrán láthatók.
A fiziológiás sókoncentráció meghatározza az NT alegységek közötti elektrosztatikus kölcsönhatásokat és az NT transzfer dimerizációját alacsonyabb pH 18-ra.Azt találtuk, hogy a 154 mM NaCl és NaF jelenléte valóban gátolja a gélesedést (5a, b ábra; 2b kiegészítő ábra), és ezek a sók növelték az NT monomerek hőstabilitását (5b. ábra, 8. kiegészítő ábra). .Azt is sugallja, hogy a stabilitás fokozása a dimerizáció helyett megakadályozza a gélképződést.
A fehérje dimerizációjának és stabilitásának a gélesedésben betöltött szerepének további feltárására két mutánst, az NT*-t és az NTA72R-t használtuk, amelyek szintén monomerek maradnak alacsony pH-n, 28,30-on.Az NT* egy kettős töltést megfordító mutáns, amelyben a monomer látszólagos dipoláris töltéseloszlása ​​ellaposodik, ami megakadályozza a dimerizációt és drasztikusan növeli a monomer stabilitását.Az NTA72R egy töltött dipólus, de az Arg-szubsztituált Ala a dimer határán helyezkedik el, így a mutációk megzavarják a dimerizációhoz szükséges alegység-kölcsönhatásokat.37 °C-on történő inkubáláskor az NT* nem képez hidrogélt, míg az NTA72R átlátszatlan gélt képez 15 percig (5c. ábra).Mivel mind az NT*, mind az NTA72R nem tud dimerizálódni, de a monomer stabilitása különbözik (5d. ábra), ezek az eredmények erősen arra utalnak, hogy a magas termodinamikai stabilitás megakadályozza az NT gélesedését.Ezt támasztja alá az a tény is, hogy a HT* gélt képez, ha magas hőmérsékleten instabil (8 perc után 60°C-on; 5c. ábra).Korábban kimutatták, hogy az NT magas metionintartalma cseppfolyósítja annak természetes feltekeredését, és hat Met-Leu helyettesítő (itt His-NT-L6-ként hivatkozunk rá) erősen stabilizálja az NT46 monomert.Abból a feltételezésből kiindulva, hogy az NT gélképződéséhez szerkezeti rugalmasságra van szükség, azt találtuk, hogy a His-NT-L6 stabil mutáns nem gélesedik 37 °C-on (5c, d ábra).Azonban a His-NT-L6 gélt is képezett 60 °C-on 60 percig inkubálva (5c. ábra).
Az NT azon képessége, hogy β-lemez szerkezetekké alakuljon át és hidrogéleket képezzen, a spidroin néhány, de nem mindegyik NT doménjére vonatkozik.A különböző selyemtípusokból és pókfajtákból származó NT-k, a Trichonephila clavipes (NTFlSp) viszonylag alacsony metionintartalmuk és magas hőstabilitásuk ellenére géleket képeztek (5e, f ábra és 2. kiegészítő táblázat).Ezzel szemben az Araneus ventricosusból (NTMiSp) származó kis ampulláris spidroinból származó, alacsony termikus stabilitású és magas metionintartalmú NT nem alkotott hidrogélt (2. kiegészítő táblázat és 5e, f ábra).Ez utóbbi összefüggésbe hozható intramolekuláris diszulfid kötések jelenlétével29,47.Következetesen, amikor az NTMiSp diszulfidkötéseit redukáltuk, 37 °C-on 10 percig végzett inkubálás után hidrogélt képez (5e. ábra).Végezetül meg kell jegyezni, hogy a szerkezeti rugalmasság fontos, de nem az egyetlen kritériuma az NT-ből történő gélképzésnek.Egy másik fontos tényező az amiloid rostok képződésére való hajlam, és a cipzár adatbázissal és a Waltz algoritmussal végzett elemzés összefüggést mutatott ki a gélképző képesség és az amiloidogén régiók jelenléte, valamint a megjósolt régiók kiterjedése között. sztérikus cipzárak kialakításához.Összefüggés mutatkozott (2. kiegészítő táblázat és 9. kiegészítő ábra).
Az NT azon képessége, hogy kedvező körülmények között fibrillumot és géleket képez, arra a hipotézisre vezetett, hogy az NT más fehérjefragmensekkel való fúziója továbbra is képes géleket képezni a fúziós partnerek teljes funkciójával.Ennek tesztelésére zöld fluoreszcens proteint (GFP) és purin nukleozid foszforilázt (PNP) vezettünk be az NT C-terminálisára.A kapott fúziós fehérjéket E. coliban expresszálták nagyon magas végső hozamokkal (150 mg/l és 256 mg/l rázott lombikkultúrák His-NT-GFP és His-NT-PNP esetében), összhangban a kimutatottakkal NT-hez fuzionált egyéb fehérjékhez Ref.30. A His-NT-GFP (300 mg/ml) és a His-NT-PNP (100 mg/ml) fúziós fehérjék 2 óra és 6,5 óra elteltével 37°C-on gélt képeztek, és ami fontos, a GFP frakció változatlan maradt.A gélesedés után megfigyelhető, a kezdeti fluoreszcencia intenzitás >70%-a megmaradt a gélesedés után (6a. ábra).A PNP aktivitás méréséhez his-NT-PNP oldatokban és gélekben a fúziós fehérjét NT-vel kellett hígítanunk, mivel a tiszta készítmény enzimatikus aktivitása a gélesedési koncentrációknál a vizsgálat kimutatási tartományán kívül volt.A 0,01 mg/ml His-NT-PNP-t és 100 mg/ml NT-t tartalmazó keverékkel képzett gél megőrizte az előinkubált minták kezdeti enzimaktivitásának 65%-át (6b. ábra).A gél sértetlen maradt a mérés során (10. kiegészítő ábra).
Relatív fluoreszcencia intenzitás a His-NT-GFP (300 mg/ml) és His-NT-GFP hidrogélt (300 mg/ml) tartalmazó megfordított fiola gélesedése előtt és után látható és UV fényben.A pontok az egyes méréseket (n = 3), a hibasávok a szórást mutatják.Az átlagos érték a hibasávok közepén látható.b A PNP-aktivitást fluorometriás analízissel határoztuk meg, NT-t (100 mg/ml), valamint 0,01 mg/ml his-NT-PNP-t és 100 mg/ml új tajvani dollárt tartalmazó keveréket tartalmazó oldatokat és géleket.A betéten egy fordított fiola látható, amely His-NT-PNP-t tartalmazó hidrogélt (5 mm-es skálasáv) tartalmaz.
Itt beszámolunk a hidrogélek képződéséről NT-ből és más rekombináns spidroin fehérjékből fehérjeoldat 37 °C-on történő inkubálásával (1. ábra).Megmutatjuk, hogy a gélesedés az α-hélixek β-rétegekké történő átalakulásával és amiloidszerű fibrillumok képződésével jár (3. és 4. ábra).Ez a megállapítás meglepő, mivel az NT-k tekercselt, gömbölyű, öt hélixből álló kötegek, amelyek rendkívül nagy oldhatóságukról és nagy stabilitásukról ismertek 4 °C-on több napon át 200 mg/ml-nél nagyobb koncentrációban27.Ezen túlmenően, az NT-k hődenaturáció után könnyen újrahajtogatnak alacsony fehérjekoncentrációnál µM-ban.Eredményeink szerint a fibrillumok kialakulásához >10 mg/mL fehérjekoncentráció és enyhén megemelt hőmérséklet kombinációja szükséges (1. ábra).Ez összhangban van azzal az elképzeléssel, hogy amiloid fibrillumok képződhetnek globulárisan feltekeredő fehérjékből, amelyek a fiziológiás körülmények között fellépő hőingadozások miatt részben széttekeredő állapotban vannak 48 .Az ezen az átalakuláson átesett fehérjék példái közé tartozik az inzulin49,50, a β2-mikroglobulin, a transztiretin és a lizozim51,52,53.Bár az NT natív állapotában α-hélix, a polipeptidlánc körülbelül 65%-a kompatibilis a sztérikus cipzárképzéssel (4e. ábra) 45 .Mivel a monomer dinamikusan mozgékony46, ezeket a potenciális amiloidogén régiókat mérsékelten megemelt hőmérsékleten kiteheti, és magas összfehérje-koncentráció esetén elérheti az amiloid fibrillumok képződésének kritikus koncentrációját54.Ezt az érvelést követve negatív korrelációt találtunk a spidroin koncentrációja és a gélesedési idő között (1c. ábra), és ha a monomer NT konformációt akár mutációkkal (NT*, His-NT-L6), akár só hozzáadásával stabilizáljuk, az megakadályozhatja a hidrogélek képződése (5. ábra).
A legtöbb esetben az amiloid rostok csapadék formájában eltűnnek az oldatból, de bizonyos körülmények között hidrogéleket képezhetnek55,56,57.A hidrogélképző fibrillák jellemzően nagy oldalaránnyal rendelkeznek, és stabil háromdimenziós hálózatokat képeznek a molekuláris összefonódás révén, 55, 58 eredményeink szerint.Az in vitro hidrogélképződéshez a fehérjék gyakran teljesen vagy részben széttekerednek, például szerves oldószereknek, magas hőmérsékletnek (70–90 °C) és/vagy alacsony pH-nak (1,5–3,0)59, 60, 61, 62.Az itt leírt spidroin hidrogélek nem igényelnek kemény feldolgozást, és nem igényelnek térhálósító szereket sem a hidrogélek stabilizálásához.
Korábban beszámoltak arról, hogy a spidroin ismétlődések és a QD-k, amelyek úgy tűnik, hogy β-lemezváltáson mennek keresztül a selyemfonás során, hidrogélt képeznek.Eredményeinkhez képest az inkubációs idők és/vagy az inkubációs hőmérsékletek szignifikánsan hosszabbak vagy magasabbak voltak, és a kapott hidrogélek gyakran átlátszatlanok voltak (7. ábra és 1. kiegészítő táblázat) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. A gyors gélesedési idők mellett a >300 mg/ml (30%) NT hidrogélek felülmúlták az összes többi leírt rekombináns pókselyemprotein hidrogélt, valamint a természetes hidrogéleket, mint például a zselatin, alginát (2%), agar (0,5%) ) és a kollagén.(0,6%) (7. ábra és 1. és 3. kiegészítő táblázat)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Ebben a vizsgálatban a hidrogélek gélesedési idejét és rugalmassági modulusát összehasonlították más spidroin alapú hidrogélekkel és kiválasztott természetes hidrogélekkel.A hivatkozásokat a gélesedési körülmények leírásával együtt adjuk meg.APS Ammónium-perszulfát, szobahőmérséklet.37., 38., 39., 64., 65., 66., 67., 68., 69., 70., 71., 72., 73., 74.
Úgy tűnik, hogy a pókok olyan módszereket fejlesztettek ki, amelyek megakadályozzák a spidroin gélesedését a tárolás során.A selyemmirigyben lévő magas fehérjekoncentráció ellenére a terminális doménhez kapcsolódó nagy ismétlődési régió azt jelenti, hogy az NT és CT látszólagos koncentrációja a mirigyben körülbelül 10-20 mg/ml-nek felel meg a vizsgálat határán.szükséges az in vitro megfigyelt hidrogélképződéshez.Ezenkívül a 16 sók hasonló koncentrációi stabilizálták az NT-t, mint a selyemmirigyekben (5b. ábra).Az NT-konformációt E. coli citoszolban tanulmányozták, és azt találták, hogy szorosabban hajtogatott, mint in vitro vizsgálva, ami tovább jelzi, hogy a só vagy más tényezők megakadályozzák aggregációját in vivo.Azonban az NT-k azon képessége, hogy β-lemez fibrillumokká alakuljanak, fontos lehet a filamentum kialakulásához, és ezt a jövőbeli vizsgálatok során meg kell vizsgálni.
Az NT-amiloidszerű fibrillumok és hidrogélképződés ebben a tanulmányban megfigyelt új szempontjain kívül azt is megmutatjuk, hogy ennek a jelenségnek biotechnológiai és orvosbiológiai alkalmazásai is lehetnek (8. ábra).A koncepció bizonyítékaként az NT-t GFP-vel vagy PNP-vel kombináltuk, és megmutattuk, hogy a fúziós fehérje 37 °C-on inkubálva is hidrogéleket képez, és a GFP és PNP frakciók nagyrészt megőrzik aktivitásukat a gélesedés után is (6. ábra).A nukleozid-foszforilázok fontos katalizátorok a nukleozid analógok szintézisében75, ami felfedezésünket relevánssá teszi a biogyógyszeripar számára.Az átlátszó hidrogélt alkotó fúziós fehérjék kedvező feltételek melletti expresszálásának koncepciója lehetővé teszi olyan funkcionalizált hidrogélek létrehozását, amelyek kedvező tulajdonságokkal rendelkeznek számos alkalmazáshoz, mint például az enzimimmobilizálás, a szabályozott gyógyszerfelszabadulás és a szövetsebészet.Ezenkívül az NT és az NT* hatékony expressziós markerek30, ami azt jelenti, hogy az NT és variánsai felhasználhatók oldható fúziós fehérjék nagy áteresztőképességű előállítására, majd immobilizált célfehérjék létrehozására 3D hidrogéleken.
Az NT oldható, α-helikális és alacsony koncentrációban (µM) és 37°C-on stabil.Azonos hőmérsékleten, de növekvő koncentrációknál (>10 mg/ml) az NT amiloidszerű fibrillákból álló géleket képez.Az NT fúziós fehérjék fibrilláris géleket is képeznek teljesen működőképes fúziós fragmentumokkal, lehetővé téve különböző fehérjék rögzítését 3D hidrogélekben NT segítségével.Alul: NT (PDB: 4FBS) és a rosthálózatok és a kapcsolódó fehérjestruktúrák illusztrációi (feltételezett és nem méretarányos, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdpdbR).
A konstrukciókat (az aminosavszekvenciákat is tartalmazó teljes listát lásd a 4. kiegészítő táblázatban) pT7 plazmidba klónoztuk, és E. coli BL21-be (DE3) transzformáltuk.A módosított plazmidokat tartalmazó E. coli-t kanamicinnel (70 mg/l) kiegészített Luria táptalajba oltottuk, és egy éjszakán át 30 °C-on, 250 fordulat/perc mellett növesztettük.A tenyészetet ezután 1/100 arányban kanamicint tartalmazó LB táptalajba oltottuk, és 30 °C-on 110 fordulat/perc sebességgel tenyésztettük, amíg az OD600 el nem érte a 0,8-at.Az NMR vizsgálatokhoz a baktériumokat 2 g D-glükóz 13C-t (Aldrich) és 1 g 15N ammónium-kloridot (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) tartalmazó M9 minimál tápközegben szaporítottuk az izotópokkal történő fehérjejelöléshez.Csökkentse a hőmérsékletet 20 Celsius-fokra, és indukálja a fehérje expresszióját 0,15 mM izopropil-tiogalaktopiranoziddal (végső koncentráció).Egy éjszakán át tartó fehérjeexpresszió után a sejteket 7278xg-nál, 4 °C-on 20 percig gyűjtöttük.A sejtpelleteket 20 mM Tris-HCl-ben (pH 8) újraszuszpendáltuk, és további felhasználásig lefagyasztottuk.A felolvasztott sejteket sejtroncsolóval (TS sorozatú gépek, Constant Systems Limited, Anglia) 30 kPa nyomáson lizáltuk.Ezután a lizátumokat 25 000 g-vel centrifugáltuk 30 percig 4 °C-on.Az NTMiSp esetében a pelletet ezután 2 M karbamidban, 20 mM Tris-HCl-ben (pH 8) újraszuszpendáltuk, és 2 percig ultrahanggal kezeltük (2 másodperc be/ki, 65%), majd ismét centrifugáltuk 25 000 xg-vel, 4 °C-on belül. 30 perc.A felülúszót Ni-NTA oszlopra töltöttük, 20 mM Tris-HCl-lel, 2 mM imidazollal (pH 8) mostuk, végül a fehérjét 20 mM Tris-HCl-lel, 200 mM imidazollal (pH 8) eluáltuk. Az NT2RepCT előállításához és NTCT, a trombin emésztés bevezeti a helyet (ThrCleav) a His és az NT közé.A trombin hasítási helyek a His-NT-ThrCleav-2Rep-ben (2Rep-et termel), His-tioredoxin-ThrCleav-NT-ben (NT-t termel), His-tioredoxin-ThrCleav-CT-ben (CT-t termel), His-Thioredoxin-NTThrCleav-ban is megtalálhatók. .* (NT*), His-Tioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp-t termel) és His-Kén-redoxin-ThrCleav-NTMiSp-t (NTMiSp-t termel).A konstrukciókat trombinnal (1:1000) emésztettük, és egy éjszakán át 4 °C-on 20 mM Tris-HCl-dal (pH 8) dializáltuk, 6-8 kDa molekulatömeg-küszöbű Spectra/Por dialízis membránt használva.Dialízis után az oldatot Ni-NTA oszlopra töltjük, és a kérdéses fehérjét tartalmazó effluenst összegyűjtjük.A fehérjekoncentrációkat 280 nm-en UV abszorbancia mérésével határoztuk meg az egyes fehérjék extinkciós koefficiensével, kivéve az NTF1Sp-t, amely a Bradford assay-t használta a gyártó protokollja szerint.A tisztaságot SDS poliakrilamid (4-20%) gélelektroforézissel és Coomassie briliánskék festéssel határoztuk meg.A fehérjéket centrifugaszűrőkkel (VivaSpin 20, GE Healthcare) koncentráltuk 4000 xg-vel, 10 kDa molekulatömeg-lezárással, 20 perces ciklusokban.
Olvassa fel a fehérjeoldatot, és óvatosan pipettázzon 150 µl-t egy 1 ml-es átlátszó septum fiolába (8 x 40 mm Thermo Scientific).A csöveket lezártuk és parafilmmel lezártuk, hogy megakadályozzuk a párolgást.A mintákat (n = 3) 37 °C-on vagy 60 °C-on inkubáltuk, és időszakonként megfordítottuk, hogy megfigyeljük a gélesedést.A nem gélesedő mintákat legalább egy hétig inkubáltuk.Csökkentse az NTMiSp diszulfid kötéseket 10 mM DTT-vel 10 µM fehérjére számítva.A természetes pókselyem bevonatok gélesedésének elemzésére a svéd hídpókot levágtuk, a két fő ampullált mirigyet 200 μl 20 mM Tris-HCl pufferbe (pH 8) helyeztük, és felvágtuk, hogy a bevonat elváljon a mirigyektől..A mirigyek tartalmát pufferben oldjuk, 50 µl-ben a száraz tömeg meghatározásához (nyitott fiolák 60 °C-on történő inkubálásával tömegállandóságig), és 150 µl-ben a gélesedéshez 37 °C-on.
A mérőgeometria/szerszám rozsdamentes acélból készül, 20 mm-es felső átmérőjű, 0,5 mm-es hézaggal rendelkező párhuzamos lemezzel.Melegítse fel a mintát 25 °C-ról 45 °C-ra, majd vissza 25 °C-ra percenként 1 °C-os sebességgel rozsdamentes acél alsó Peltier-lemez segítségével.A vibrációs méréseket 0,1 Hz frekvencián, az anyag lineáris viszkoelasztikus tartományában 5%-os, illetve 0,5%-os nyúlásnál végeztük a 100 mg/ml, illetve 300-500 mg/ml minták esetén.Használjon egyedi páratartalmú kamrát a párolgás megelőzésére.Az adatokat Prism 9 segítségével elemeztük.
Infravörös (IR) spektrumok gyűjtésére szobahőmérsékleten 800-3900 cm–1.Az ATR készüléket, valamint a spektrométeren áthaladó fényutat száraz, szűrt levegővel átöblítjük a kísérlet előtt és alatt.Az oldatokat (500 mg/ml a vízabszorpciós csúcsok minimálisra csökkentése érdekében a spektrumokban) pipettával a kristályokra pipettáztuk, és a mérés előtt géleket (500 mg/ml) képeztünk, majd átvittük a kristályokra (n=3).1000 pásztázást rögzítettünk 2 cm-1 felbontással és 2 nulla munkaciklussal. A második derivált OPUS (Bruker) segítségével számítottuk ki kilencpontos simítási tartományban.A spektrumokat ugyanarra az integrációs tartományra normalizáltuk 1720 és 1580 cm-1 között F. Menges „Spectragryph – Optical Spectroscopy Software” segítségével.Az ATR-IR spektroszkópiában az infravörös sugár behatolási mélysége a mintába hullámszámfüggő, ami kisebb hullámszámoknál erősebb abszorpciót eredményez, mint nagyobb hullámszámoknál.Ezeket a hatásokat nem korrigálták az 1-1.3, mert nagyon kicsik (4. kiegészítő ábra).Ennek az ábrának a korrigált spektrumait a Bruker OPUS szoftverrel számítottuk ki.
Elvileg a fehérjekonformációk átfogó mennyiségi meghatározása lehetséges az amid I csúcson belüli komponensek megbízható dekonvolúciója után.A gyakorlatban azonban felmerül néhány akadály.A spektrumban lévő zaj (hamis) csúcsként jelenhet meg a dekonvolúció során.Ráadásul a vízhajlításból adódó csúcs egybeesik az amid I. csúcs helyzetével, és hasonló nagyságrendű lehet a nagy mennyiségű vizet tartalmazó minták, például az itt vizsgált vizes gél esetében.Ezért nem kíséreltük meg az amid I csúcs teljes lebontását, és megfigyeléseinket csak más módszerek, például az NMR spektroszkópia alátámasztására érdemes figyelembe venni.
Az 50 mg/ml NT és His-NT2RepCT oldatait egy éjszakán át 37 °C-on gélesítettük.A hidrogélt ezután 20 mM Tris-HCl-dal (pH 8) 12,5 mg/ml koncentrációra hígítottuk, jól összeráztuk és pipettáztuk, hogy a gél széttörjön.Ezt követően a hidrogélt 10-szer hígítottuk 20 mM Tris-HCl-lel (pH 8), a mintából 5 μl-t formvarral bevont rézrácsra vittünk, és a felesleges mintát itatópapírral eltávolítottuk.A mintákat kétszer mostuk 5 µl MilliQ vízzel, és 1%-os uranil-formiáttal festettük 5 percig.Távolítsa el a felesleges foltot nedvszívó papírral, majd szárítsa meg levegőn a hálót.A képalkotást ezeken a rácsokon 100 kV-on működő FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN készülékkel végeztük.A képeket 26 500-szeres és 43 000-szeres nagyítással rögzítettük Veleta 2k × 2k CCD-kamerával (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Németország).Minden mintához (n = 1) 10-15 képet rögzítettünk.Az ImageJ (https://imagej.nih.gov/) képelemzést és a szálátmérők mérését (n = 100, különböző szálak) használták.A Prism 9-et használták páratlan t-tesztek (kétfarkú) végrehajtására.Az átlagos His-NT2RepCT és NT fibrillumok 11,43 (SD 2,035) és 7,67 (SD 1,389) nm voltak.A konfidencia intervallum (95%) -4,246 és -3,275 között van.szabadsági fok = 198, p < 0,0001.
80 µl 10 µM tioflavin T-t (ThT) tartalmazó folyékony mintát mértünk három párhuzamosban (n = 3) statikus körülmények között Corning 96 lyukú, fekete fenekű átlátszó fenekű lemezekkel (Corning Glass 3881, USA).A fluoreszcencia különbségeket 440 nm-es gerjesztőszűrő és 480 nm-es emissziós szűrő (FLUOStar Galaxy, BMG Labtech, Offenburg, Németország) segítségével rögzítettük.A ThT jel nem volt sem telítve, sem kioltva, mivel a ThT különböző koncentrációival végzett kísérleteket a jel intenzitásának megváltoztatása nélkül végeztük.Rögzítse az abszorbanciát 360 nm-en a homályméréshez.Az oltási kísérletekhez 100 mg/ml-es géleket állítottunk elő 37 °C-on, újraszuszpendáltuk, és 5%, 10% és 20% mólarányban alkalmaztuk oltásra.Az adatokat Prism 9 segítségével elemeztük.
Olvassa fel a His-NT2RepCT és NT >100 mg/ml törzsoldatait jégen, és szűrje át egy 0,22 µm-es szűrőn.A koncentrációkat 280 nm-en mért abszorbancia Nanodrop segítségével számítottuk ki.Egy átlátszó fenekű, 96 lyukú fekete, nem kötő lemez (Corning) üregeiben a mintákat 20 mg/ml-re hígítottuk 20 mM Tris-HCl-ben (pH 8), és összekevertük 5 µM ThT-vel (végső koncentráció), a teljes mintakoncentráció. 50 μl térfogat.A mintákat 10 percenként 37 °C-on leképeztük CellObserver (Zeiss) mikroszkóppal, áteresztett fénycsatornával és FITC gerjesztő és emissziós szűrőkészlettel a ThT képalkotáshoz.A képalkotáshoz 20x/0,4-es objektívet használnak.A Zen Blue (Zeiss) és az ImageJ (https://imagej.nih.gov/) képelemzést használtuk.Géleket is készítettünk NT és His-NT2RepCT oldatokból 50 mg/ml koncentrációban, amely 20 mM Tris pH 8-at és 5 µM ThT-t tartalmazott, és 37 °C-on 90 percig inkubáltuk.A géldarabokat egy új, 20 mM Tris-t (pH 8) és 5 µM ThT-t tartalmazó lyukba vittük át egy nem-kötő fekete 96 lyukú átlátszó fenéklemezen.Zöld fluoreszcenciát és fényes mezőt készíthet 20-szoros/0,4-es nagyítással.Az ImageJ-t képelemzésre használták.
Az oldat NMR-spektrumait 310 K-en vettük egy 600 MHz-es Bruker Avance Neo spektrométeren, amely QCI Quadrupol Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) volt.NMR-minták, amelyek 10 mg/ml homogén fehérjét tartalmaznak 13C, 15N jelzett, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) oldatban. .Az NT2RepCT kémiai eltolódásait pH 6,7-nél alkalmaztuk a 23. csúcs hozzárendeléséhez a 15N-HSQC 2D spektrumában.
A 13C, 15N jelölt hidrogélek mágikus szögben forgó szilárd NMR (MAS) spektrumát Bruker Avance III HD spektrométerrel vettük fel 800 MHz-en, amely 3,2 mm-es 13C/15N{1H} elektronmentes szondával volt felszerelve.A minta hőmérsékletét változtatható hőmérsékletű gázárammal szabályoztuk 277 K-en. A kétdimenziós dipólus rotációs rezonancia (DARR)76 és rádiófrekvenciás visszakapcsolási (RFDR)77 spektrumokat 12,5 kHz-es, illetve 20 kHz-es MAS-frekvenciákon vettük fel.A keresztpolarizációt (CP) 1H-ról 13C-ra 60,0-48,0 kHz-es lineáris rámpával hajtottuk végre 1H-on, 61,3/71,6 kHz-en 13C-on (12,5/20 kHz-en MAS) és 0,5-1 ms érintkezési időt.Az adatgyűjtés során a 73,5 kHz-es Spinal6478 leválasztást alkalmaztuk.A felvételi idő 10 ezredmásodperc, a cikluskésés 2,5 másodperc volt.Az RFDR spektrumokban megfigyelt egyszeresen kapcsolt Cα/Cβ korrelációkat a DARR spektrumokban található jellegzetes maradék-típusú kémiai eltolódások és többszörösen kapcsolt korrelációk alapján rendeltük hozzá.
A Zipper79 adatbázist (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) használták az NT, NTFlSp és NTMiSp lebegési tendenciáinak és Rosetta-energiájának értékelésére.A Zipper adatbázis a Rosetta Energy80-at számítja ki, amely számos szabadenergia-függvényt kombinál a fehérjeszerkezet modellezésére és elemzésére.A -23 kcal/mol vagy annál alacsonyabb energiaszint magas fibrillációs hajlamot jelez.Az alacsonyabb energia a két β-szál nagyobb stabilitását jelenti a cipzár konformációjában.Ezenkívül a Waltz algoritmust használták az NT, NTFlSp és NTMiSp Ref amiloidogén régióinak előrejelzésére.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Az NT fehérjeoldatot 2-(N-morfolino)etánszulfonsav (MES) pufferrel kevertük össze pH 5,5 és 6,0 értéknél, hogy a pH-t 6-ra, illetve 7-re csökkentsük.A végső fehérjekoncentráció 100 mg/ml volt.
A méréseket J-1500 CD spektrométeren (JASCO, USA) 300 μl-es küvettával végeztük, 0,1 cm-es optikai úttal.A fehérjéket 10 μM-ra (n = 1) hígítottuk 20 mM foszfátpufferben (pH 8).A fehérjék só jelenlétében való stabilitásának elemzéséhez a fehérjéket azonos koncentrációban (n = 1) 20 mM foszfátpufferben (pH 8), amely 154 mM NaF-ot, illetve NaCl-t tartalmazott, analizáltunk.A hőmérsékleti letapogatást 222 nm-en vettük fel 25 °C és 95 °C között, 1 °C/perc fűtési sebesség mellett.A natívan hajtogatott fehérjék arányát a (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) képlet segítségével számítottuk ki.Ezenkívül minden mintára öt spektrumot vettünk fel 260 nm és 190 nm között 25 °C-on és 95 °C-ra való melegítés után.Öt spektrumot átlagoltunk, kisimítottunk és moláris ellipticitássá konvertáltunk.Az adatokat Prism 9 segítségével elemeztük.
A His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µl) fluoreszcencia intenzitását három párhuzamosban (n = 3) mértük 96 lyukú, fekete átlátszó aljú Corning lemezeken (Corning Glass 3881, USA) statikus körülmények között.Mérjük meg a mintákat fluoreszcencia alapú lemezleolvasóval 395 nm gerjesztési hullámhosszon, és rögzítsük az emissziót 509 nm-en a gélesedés előtt és 2 órával később 37 °C-on.Az adatokat Prism 9 segítségével elemeztük.
Purin nukleozid foszforiláz aktivitást vizsgáló készletet (fluorometrikus módszer, Sigma Aldrich) használtunk a gyártó utasításai szerint.Az aktivitás méréséhez His-NT-PNP-t tartalmazó gélekben és oldatokban keverjen össze 10 ng His-NT-PNP-t 100 mg/ml NT-vel 2 µl össztérfogatig, mert a gél a készlet kimutatási intervallumán felüli jelet adott.A His-NT-PNP-t nem tartalmazó gélek és oldatok kontrolljait tartalmaztuk.A méréseket kétszer végeztük el (n = 2).Az aktivitás mérése után a reakcióelegyet eltávolítottuk, és a gélt lefényképeztük, hogy a gél sértetlen maradjon a mérés során.Az adatokat Prism 9 segítségével elemeztük.
A tanulmányok tervezésével kapcsolatos további információkért tekintse meg a cikkhez kapcsolódó természettanulmány-absztraktot.
Az 1. és 2. ábra a kiindulási adatokat mutatja be.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f és 6, kiegészítő ábra.3. kiegészítő ábra.5a, d, kiegészítő ábra.6. ábra és kiegészítő ábra.8. Adatok A tanulmányból származó adatok a Zenodo adatbázisban találhatók: https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Az ebben a vizsgálatban kapott NMR-adatokat a BMRBig adattárba tették közzé a bmrbig36 bejegyzés azonosítója alatt.A GFP és a PNP szerkezetét a PDB-ből vettük (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. és Johansson, J. Spinning mesterséges pók selyem.National Chemical.biológia.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.A Nephila clavipes genom rávilágít a pókselyem gének sokféleségére és összetett expressziójára.National Genette.49, 895–903 (2017).