347 12.7*1.24mm Rozsdamentes acél tekercses cső, α-synuclein és tau szinkron elektrosztatikus kondenzációjának és koaggregációjának molekuláris mechanizmusa

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Olyan böngészőverziót használ, amely korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Ezenkívül a folyamatos támogatás érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Diánként három cikket mutató csúszkák.Használja a vissza és a következő gombokat a diák közötti mozgáshoz, vagy a végén lévő diavezérlő gombokat az egyes diák közötti mozgáshoz.

347 Rozsdamentes acélcső specifikáció

347 12,7*1,24mm Rozsdamentes acél tekercses cső

Külső átmérő: 6,00 mm-es külső átmérőig 914,4 mm-es külső átmérőig, méretek 24”-ig NB elérhető raktárról, külső átmérőjű acélcsövek kaphatók készletről

SS 347 csővastagság tartomány: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S stb. (0,5-12 mm) Vagy nem normál méret, igény szerint testreszabható

Típus: SS 347 varrat nélküli csövek |SS 347 ERW csövek |SS 347 hegesztett csövek |SS 347 gyártott csövek |SS 347 CDW csövek, LSAW csövek / Varrathegesztett / Újrarajzolt

Forma: SS 347 kerek csövek, SS 347 négyzet alakú csövek, SS 347 téglalap alakú csövek, SS 347 tekercses csövek, SS 347 "U" alakú, SS 347 serpenyős torta tekercsek, SS 347 hidraulikus csövek

Hossz: egyszeres véletlenszerű, kettős véletlenszerű és kötelező hosszvég: sima vég, ferde vég, taposott

Végvédelem: Műanyag kupakok |Külső burkolat: 2B, No.4, No.1, No.8 Tükörbevonat rozsdamentes acélcsövekhez, a vevői követelményeknek megfelelő felületkezelés

Szállítási állapot: lágyított és pácolt, polírozott, fényes izzítás, hidegen húzott

Ellenőrzés, vizsgálati jelentések: malomvizsgálati tanúsítványok, EN 10204 3.1, kémiai jelentések, mechanikai jelentések, PMI vizsgálati jelentések, vizuális ellenőrzési jelentések, harmadik féltől származó vizsgálati jelentések, NABL által jóváhagyott laboratóriumi jelentések, roncsolásos vizsgálati jegyzőkönyvek, roncsolásmentes vizsgálati jelentések

Csomagolás: fadobozokba, műanyag zacskókba, acélcsíkokba csomagolva, vagy az ügyfelek kérése szerint

Különlegességek: Kérésre a fentitől eltérő méretek és specifikációk is legyárthatók

SS 347 csőméret tartomány: 1/2 hüvelykes NB, OD-24 hüvelyk

ASTM A312 347: Varrat nélküli és egyenes varratú hegesztett ausztenites cső, magas hőmérsékleten és általános korrózióval szembeni használatra.Hegesztés közben nem megengedett a töltőanyag.

ASTM A358 347: Elektromos fúziós hegesztésű ausztenites cső korrozív és/vagy magas hőmérsékletű használatra.Általában csak legfeljebb 8 hüvelykes csövet gyártanak ennek a specifikációnak megfelelően.Hegesztés közben töltőanyag hozzáadása megengedett.

ASTM A790 347: Varrat nélküli és egyenes varratú hegesztett ferrites/ausztenites (duplex) cső, amelyet általános korrozív szolgáltatásra terveztek, különös tekintettel a feszültségkorróziós repedésekkel szembeni ellenállásra.

ASTM A409 347: Egyenes varratú vagy spirálvarratú, elektromos fúziós hegesztésű, nagy átmérőjű ausztenites fényfalú cső 14” és 30” közötti méretben Sch5S és Sch 10S falakkal korrozív és/vagy magas

ASTM A376 347: Varrat nélküli ausztenites cső magas hőmérsékletű alkalmazásokhoz.

ASTM A813 347: Egyvarratú, egy- vagy kettős hegesztésű ausztenites csövek magas hőmérsékletű és általános korrozív alkalmazásokhoz.

ASTM A814 347: Hidegen megmunkált hegesztett ausztenites cső magas hőmérsékletű és általános korrozív használathoz.

347H rozsdamentes acél csövek kémiai összetétele

Rozsdamentes acél 347H csőmechanikai tulajdonságok

Rozsdamentes acél 347H csövek Fizikai tulajdonságok

Egyenértékű minőség a 347H rozsdamentes acélcsőhöz

Az amiloid alfa-synuclein (αS) aggregáció a Parkinson-kór és más synucleinopathiák ismertetőjele.A közelmúltban az Alzheimer-kórhoz gyakran társuló tau-fehérjét αS-patológiával hozták összefüggésbe, és azt találták, hogy az αS-ben gazdag zárványokban együttesen lokalizálódik, bár a két fehérje koaggregációjának molekuláris mechanizmusa továbbra is tisztázatlan.Itt beszámolunk arról, hogy az αS fázis folyékony kondenzátummá válik szét elektrosztatikus komplex kondenzáció révén pozitív töltésű polipeptidekkel, például tau-val.Az αS polikationokhoz való affinitásától és a koagulációs hálózat vegyértékcsökkenésének sebességétől függően a vérrögök gyors gélesedésen vagy összeolvadáson mennek keresztül, amelyet lassú amiloid aggregáció követ.Fejlett biofizikai technikák kombinációjával jellemezni tudtuk a folyadék-folyadék αS/Tau fázisszétválasztást, és azonosítani tudtuk azokat a kulcstényezőket, amelyek mindkét fehérjét tartalmazó heterogén aggregátumok kialakulásához vezetnek egy folyékony fehérjekondenzátumban.
A sejtekben a térbeli elválasztás a membránkompartmentek mellett fehérjében gazdag, folyadékszerű sűrű testek, úgynevezett biomolekuláris kondenzátumok vagy cseppek képződésével is megvalósítható, a folyadék-folyadék fázisszétválasztás (LLPS) néven ismert eljárás révén.Ezek a cseppek multivalens időbeli kölcsönhatások során jönnek létre, általában fehérjék vagy fehérjék és RNS között, és szinte minden élő rendszerben különféle funkciókat látnak el.Számos LLP-képes fehérje alacsony komplexitású szekvenciákat mutat, amelyek természetükben és a biomolekuláris kondenzátumok képződésében rendkívül rendezetlenek3,4,5.Számos kísérleti tanulmány tárta fel a folyadékszerű kondenzátumokat alkotó fehérjék rugalmas, gyakran rendezetlen és többértékű természetét, bár keveset tudunk azokról a specifikus molekuláris determinánsokról, amelyek szabályozzák ezeknek a kondenzátumoknak a növekedését és érését szilárdabbra. állapot..
Az új adatok alátámasztják azt a hipotézist, hogy az aberráns fehérje által vezérelt LLPS és a cseppek szilárd struktúrákká való átalakulása releváns sejtpályák lehetnek, amelyek oldhatatlan toxikus aggregátumok kialakulásához vezetnek, amelyek gyakran a degeneratív betegségek ismertetőjegyei.Sok, az LLPS-hez kapcsolódó belsőleg rendezetlen fehérje (IDP), gyakran erősen feltöltött és rugalmas, régóta összefüggésbe hozható a neurodegenerációval az amiloid aggregáció folyamatán keresztül.Különösen a biomolekuláris IDP kondenzátumokról, például a FUS7-ről vagy a TDP-438-ról, vagy a nagy, alacsony komplexitású doménekkel rendelkező fehérjékről, például a hnRNPA19-ről kimutatták, hogy a fluidizációnak nevezett folyamat révén gélszerű vagy akár szilárd formákká öregednek.összetett.szilárd fázisú átmenethez (LSPT) az idő függvényében vagy bizonyos poszttranszlációs módosulásokra vagy patológiásan jelentős mutációkra adott válaszként1,7.
Az LLPS-hez in vivo kapcsolódó másik IDP a Tau, egy mikrotubulusokhoz kapcsolódó rendezetlen fehérje, amelynek amiloid aggregációja szerepet játszik az Alzheimer-kórban10, de a közelmúltban a Parkinson-kórban (PD) és más szinaptikus nukleáris proteinopátiákban 11, 12, 13 is összefügg.Kimutatták, hogy a Tau spontán disszociál az oldatból/citoplazmából a kedvező elektrosztatikus kölcsönhatások miatt14, ami tau-dús cseppecskék képződését eredményezi, elektrosztatikus koacervátumként ismert.Azt is megfigyelték, hogy ez a fajta nem specifikus kölcsönhatás a természetben található számos biomolekuláris kondenzátum hajtóereje15.Tau fehérje esetén az elektrosztatikus aggregáció létrejöhet egyszerű aggregációval, amelyben a fehérje ellentétes töltésű régiói váltják ki a hasítási folyamatot, vagy komplex aggregációval, negatív töltésű polimerekkel, például RNS-sel való kölcsönhatás révén.
A közelmúltban az α-synucleint (αS), egy amiloid IDP-t, amely szerepet játszik a PD-ben és más neurodegeneratív betegségekben, amelyek együttesen synucleinopathiaként ismertek17,18, sejt- és állatmodellekben19,20 kimutatták, folyadékszerű viselkedésű fehérjekondenzátumokban koncentráltan.In vitro vizsgálatok kimutatták, hogy az αS egyszerű aggregáción megy keresztül LLPS-en túlnyomórészt hidrofób kölcsönhatások révén, bár ez a folyamat kivételesen magas fehérjekoncentrációt és atipikusan hosszú inkubációs időt igényel19,21.Továbbra is kulcsfontosságú megoldatlan kérdés, hogy az in vivo megfigyelt αS-tartalmú kondenzátumok ez vagy más LLPS folyamatok során keletkeznek-e.Hasonlóképpen, bár αS amiloid aggregációt figyeltek meg a neuronokban PD és más synucleinopathiák esetén, a pontos mechanizmus, amellyel az αS intracelluláris amiloid aggregáción megy keresztül, továbbra is tisztázatlan, mivel úgy tűnik, hogy e fehérje túlzott expressziója önmagában nem váltja ki ezt a folyamatot.Gyakran további sejtkárosodásra van szükség, ami arra utal, hogy bizonyos sejtes helyekre vagy mikrokörnyezetekre van szükség az intracelluláris αS amiloid szerelvények renukleációjához.Az egyik sejtkörnyezet, amely különösen hajlamos az aggregációra, a fehérje kondenzátumok belseje lehet 23 .
Érdekes módon azt találták, hogy az αS és a tau együttesen lokalizálódnak a Parkinson-kórban és más szinukleinopátiában szenvedő emberek jellegzetes betegségzárványaiban 24, 25, és a kísérletek szinergikus patológiás kapcsolatról számoltak be a két fehérje között 26, 27, ami potenciális kapcsolatra utal az αS és az aggregáció között. tau neurodegeneratív betegségekben.betegség.Azt találták, hogy az αS és a tau kölcsönhatásba lépnek, és elősegítik egymás aggregációját in vitro és in vivo 28, 29 és e két fehérjéből álló heterogén aggregátumokat figyeltek meg a synucleinopathiában szenvedő betegek agyában 30 .Azonban keveset tudunk az αS és tau közötti kölcsönhatás molekuláris alapjáról és ko-aggregációjának mechanizmusáról.Beszámoltak róla, hogy az αS kölcsönhatásba lép a tau-val az αS erősen negatív töltésű C-terminális régiója és a tau központi prolinban gazdag régiója közötti elektrosztatikus vonzás révén, amely szintén gazdag pozitív töltésű aminosavakban.
Ebben a tanulmányban megmutatjuk, hogy az αS valóban cseppekké disszociálhat elektrosztatikus komplex kondenzáció révén tau fehérje jelenlétében, ellentétben más pozitív töltésű polipeptidekkel, például poli-L-lizinnel (pLK), és ebben a folyamatban kölcsönhatásba lép.Az αS állványmolekulaként működik a csepphálózat számára.Észrevehető különbségeket azonosítottunk az elektrosztatikus αS koacervátumok érésének folyamatában, amelyek a koacervátum hálózatban részt vevő fehérjék kölcsönhatásának valenciájában és erősségében mutatkozó különbségekkel függnek össze.Érdekes módon megfigyeltük az αS és tau amiloid fehérjék együttes aggregációját hosszú élettartamú folyékony koacervátumokban, és azonosítottunk néhány kulcsfontosságú tényezőt, amelyek e két fehérje együttes aggregációjához vezetnek ilyen koacervátumokban.Itt részletesen leírjuk ezt a folyamatot, amely egy lehetséges molekuláris mechanizmus, amely két fehérje kolokalizációjának hátterében áll a betegség-specifikus zárványokban.
Az αS erősen anionos C-terminális farokkal rendelkezik semleges pH-n (1a. ábra), és feltételeztük, hogy LLPS-en megy keresztül az elektrosztatikus komplexek kondenzációja révén polikationos rendezetlen polipeptidmolekulákkal.Kiindulási modell molekulaként egy 100 aminosavból álló poli-L-lizint (pLK) használtunk pozitív töltésű és rendezetlen polimer természete miatt semleges pH-n 32. Először is megerősítettük, hogy a pLK kölcsönhatásba lép az αS Ct doménjével oldat-NMR spektroszkópiával. (1b. ábra) 13C/15N-jelzett αS alkalmazásával növekvő αS:pLK mólarányok jelenlétében.A pLK kölcsönhatása az αS Ct-doménjével a kémiai eltolódás zavaraiban és a fehérje ezen régiójában a csúcsintenzitás csökkenésében nyilvánul meg.Érdekes módon, amikor αS-t pLK-val kevertünk kb.5-25 µM polietilénglikol (5-15% PEG-8) jelenlétében (tipikus LLPS puffer: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) azonnal a fehérjeképzés széles területén mentünk keresztül .A cseppeket fluoreszcencia (WF) és fényes mező (BF) mikroszkóppal figyeltük meg (1c. ábra).1-5 µm-es, koncentrált αS-t tartalmazó cseppek (1 µM AlexaFluor488-mal jelölt αS, AF488-αS hozzáadásával), elektrosztatikus tulajdonságaik a 10% 1,6-hexándiollal (1,6-HD) szembeni ellenállásukból és érzékenységükből származtathatók. a NaCl koncentráció növekedése (1c. ábra).Az αS/pLK elektrosztatikus komplex koacervátumainak folyadékszerű természetét mutatja, hogy ezredmásodperceken belül összeolvadnak (1d. ábra).Turbidimetria segítségével számszerűsítettük a cseppek képződését ilyen körülmények között, megerősítettük a stabilitással összefüggő fő kölcsönhatás elektrosztatikus jellegét (1e. ábra), és értékeltük a különböző polimerarányok hatását az LLPS folyamatra (1f. ábra).Bár a polimerarányok széles tartományában megfigyelhető cseppképződés, az eljárás nagyon kedvező, ha a pLK meghaladja az αS-t.Az LLP-ket a kémiailag eltérő kiszorítószer, a dextrán-70 (70 kDa) vagy különféle mintaformátumok használatával is megfigyelték, beleértve az üvegcseppeket, a különböző anyagokból készült mikrolemez-lyukakat, az Eppendorf- vagy kvarckapillárisokat.
a tanulmányban használt WT-αS és ΔCt-αS variánsok különböző fehérjerégióinak sematikus ábrázolása.Az amfipatikus N-terminális domén, a hidrofób amiloidképző (NAC) régió és a negatív töltésű C-terminális domén kék, narancssárga és piros színnel láthatók.Megjelenik a WT-αS nettó maradékdíj (NCPR) térképe.b Az αS/pLK kölcsönhatás NMR analízise makromolekuláris csomók hiányában.A pLK-koncentráció növekedésével (az 1:0,5, 1:1,5 és 1:10 αS:pLK mólarány világoszöld, zöld és sötétzöld színnel van feltüntetve).c Koacerválj αS/pLK-t (mólarány 1:10) 25 µM-on (1 µM AF488-mal jelölt αS vagy Atto647N-jelzett pLK a WF képalkotáshoz) LLPS pufferben (fent) vagy 500 mM NaCl-dal kiegészítve (balra lent) vagy utána % 1,6-hexándiol (1,6-HD; jobbra lent).Skálasáv = 20 µm.d Reprezentatív mikroszkópos felvételek az αS/pLK (1:10 mólarány) BF csepp fúziójáról 25 μM koncentrációban;nyilak jelzik az egyes cseppek (piros és sárga nyilak) új cseppté (narancssárga nyíl) egyesülését 200 ms-on belül) .Skálasáv = 20 µm.e Fényszórás (350 nm-en) αS/pLK aggregáció LLPS pufferben 500 mM NaCl vagy 10% 1,6-HD hozzáadása előtt és után 25 µM αS mellett (N = 3 minta ismétlés, az átlag és a szórás is feltüntetve).f BF kép (felül) és fényszórási analízis (350 nm-en, alul) az αS/pLK aggregációjáról 25 μM αS mellett, növekvő αS:pLK mólarány mellett (N = 3 minta ismétlés, az átlag és a szórás is feltüntetve).Skálasáv = 10 µm.Az egy képen lévő léptéksáv az egy panelen lévő összes kép léptékét jelzi.A nyers adatok nyers adatfájlok formájában állnak rendelkezésre.
Az αS/pLK elektrosztatikus komplex kondenzációjával kapcsolatos megfigyeléseink és az αS mint a tau/RNS kondenzátum kliensmolekulájának korábbi megfigyelései alapján a tau31-gyel való közvetlen kölcsönhatás révén azt feltételeztük, hogy az αS és a tau együtt tud szegregálódni az oldószerrel RNS hiányában. páralecsapódás.elektrosztatikus komplexeken keresztül, és az αS a vázfehérje az αS/Tau koacervátumokban (lásd a tau töltéseloszlást a 2e. ábrán).Megfigyeltük, hogy amikor 10 μM αS-t és 10 μM Tau441-et (amely 1 μM AF488-αS-t és 1 μM Atto647N-Tau-t tartalmaz) összekeverünk LLPS pufferben, könnyen képeztek mindkét fehérjét tartalmazó fehérje aggregátumokat, amint azt WF mikroszkóppal is láthattuk.(2a. ábra).A két fehérje kolokalizációját a cseppekben konfokális (CF) mikroszkóppal igazoltuk (kiegészítő 1a. ábra).Hasonló viselkedést figyeltek meg, amikor a dextrán-70-et aggregációs szerként használták (1c. kiegészítő ábra).FITC-vel jelölt PEG vagy dextrán használatával azt találtuk, hogy mindkét zsúfolt anyag egyenletesen oszlott el a minták között, nem mutatva sem szegregációt, sem asszociációt (kiegészítő 1d. ábra).Inkább azt sugallja, hogy ebben a rendszerben elősegítik a fázisszétválasztást a makromolekuláris zsúfolt hatások révén, mivel a PEG előnyösen stabil zsúfolt ágens, amint az más LLP rendszerekben is látható33,34.Ezek a fehérjében gazdag cseppek érzékenyek voltak NaCl-ra (1 M), de nem érzékenyek az 1,6-HD-re (10% v/v), ami megerősíti elektrosztatikus tulajdonságaikat (Kiegészítő 2a, b ábra).Folyadék viselkedésüket a BF mikroszkóppal megfigyelt ezredmásodperces összeolvadó cseppesemények igazolták (2b. ábra).
a Konfokális (CF) mikroszkópos felvételek az αS/Tau441 koacervátumokról LLPS pufferben (10 μM minden fehérjéből, 0,5 μM AF488-mal jelölt αS és Atto647N-jelzett Tau441).b Reprezentatív differenciális interferenciakontraszt (DIC) képek az αS/Tau441 cseppfúziós eseményekről (10 μM minden fehérjéhez).c Fázisdiagram a Tau441 LLPS (0–15 µM) fényszórásán (350 nm-en) 50 µM αS hiányában (balra) vagy jelenlétében (jobbra).A melegebb színek nagyobb szórást jeleznek.d αS/Tau441 LLPS minták fényszórása növekvő αS koncentráció mellett (Tau441 5 µM-nál, N = 2–3 mintaismétlés a jelzett módon).e A tanulmányban használt tau-fehérje-változatok és a fehérje különböző régióinak sematikus ábrázolása: negatív töltésű N-terminális domén (piros), prolinban gazdag régió (kék), mikrotubulus-kötő domén (MTBD, narancssárgával kiemelve), és amiloidképző pár spirál.filament régiók (PHF) az MTBD-n belül (szürke).Megjelenik a Tau441 nettó maradék töltési (NCPR) térképe.f 1 µM AF488-jelzett αS és Atto647N-jelzett ΔNt- használata, 1 µM AF488-jelzett αS vagy ΔCt-αS használata ΔNt-Tau jelenlétében (felső, 10 µM fehérjénként, vagy K10 µM fehérjénként ) ) ) LLPS vagy K18 pufferben kondenzált WF mikrofelvételei.Az egy képen lévő léptéksávok az egy panelen lévő összes kép méretarányát jelzik (20 µm az a, b és f panelek esetén).A c és d panelek nyers adatai nyers adatfájlokként állnak rendelkezésre.
Az αS ebben az LLPS-folyamatban betöltött szerepének tesztelésére először az αS cseppstabilitásra gyakorolt ​​hatását vizsgáltuk nefelometriával, növekvő NaCl-koncentrációval (2c. ábra).Minél nagyobb a sókoncentráció az αS-t tartalmazó mintákban, annál magasabbak a fényszórási értékek (350 nm-en), ami az αS stabilizáló szerepét jelzi ebben az LLPS rendszerben.Hasonló hatás figyelhető meg, ha az αS koncentrációt (és ezzel az αS:Tau441 arányt) kb.10-szeres növekedés a tau-koncentrációhoz (5 µM) képest (2d. ábra).Annak bizonyítására, hogy az αS egy vázfehérje a koacervátumokban, úgy döntöttünk, hogy megvizsgáljuk az LLPS-elroncsolt Tau mutáns viselkedését, amelyből hiányzik a ΔNt-Tau nevű negatív töltésű N-terminális régió (1-150 aminosavak, lásd 2e. ábra).A WF-mikroszkópia és a nefelometria megerősítette, hogy maga a ΔNt-Tau nem esett át LLPS-en (2f. ábra és 2d. kiegészítő ábra), amint azt korábban közöltük 14. Amikor azonban αS-t adtunk a csonka Tau-változat diszperziós oldataihoz, az LLPS folyamat teljesen lezajlott. visszaállították a Tau és αS teljes méretű oldatának cseppsűrűségéhez hasonló cseppsűrűséggel hasonló körülmények és fehérjekoncentrációk mellett.Ez a folyamat alacsony makromolekuláris zsúfoltság mellett is megfigyelhető (2c. kiegészítő ábra).A C-terminális αS régió, de nem teljes hosszának szerepét az LLPS folyamatban a cseppképződés gátlása bizonyította a (ΔCt-) C-terminális csonka αS variánsának alkalmazásával, amelyből hiányzik a (ΔCt-) 104–140. aminosavai (1a. ábra). αS) fehérje (2f. ábra és 2d. kiegészítő ábra).Az αS és a ΔNt-Tau kolokalizációját konfokális fluoreszcens mikroszkóppal igazoltuk (kiegészítő 1b. ábra).
A Tau441 és az αS közötti LLPS-mechanizmus további tesztelésére egy további Tau-változatot alkalmaztak, nevezetesen a mikrotubulus-kötő doménben (MTBD) lévő páros helikális filamentum (PHF) fragmentumot, amely, ha négy jellegzetes ismétlődő domént tartalmaz, amelyek általában szintén ismertek. mint a K18 fragmentum (lásd 2e. ábra).A közelmúltban arról számoltak be, hogy az αS előnyösen egy prolinban gazdag doménben található tau fehérjéhez kötődik a mikrotubulus-kötő domént megelőző szekvenciában.A PHF-régió azonban gazdag pozitív töltésű maradékokban is (lásd 2e. ábra), különösen lizinben (15% maradék), ami arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk, hogy ez a régió is hozzájárul-e az αS/Tau komplex kondenzációjához.Megfigyeltük, hogy a K18 önmagában nem tudta kiváltani az LLPS-t 100 μM-ig terjedő koncentrációban a vizsgált körülmények között (LLPS puffer 15% PEG-gel vagy 20% dextránnal) (2f ábra).Ha azonban 50 µM αS-t adtunk 50 µM K18-hoz, nefelometriával (2d. kiegészítő ábra) és WF-mikroszkópiával (2f. ábra) K18-at és αS-t tartalmazó fehérjecseppek gyors képződését figyeltük meg.Ahogy az várható volt, a ΔCt-αS nem tudta visszaállítani a K18 LLPS viselkedését (2f. ábra).Megjegyezzük, hogy az αS/K18 aggregációhoz valamivel magasabb fehérjekoncentrációra van szükség az LLPS indukálásához, mint az αS/ΔNt-Tau-hoz vagy az αS/Tau441-hez, más tényezők azonosak mellett.Ez összhangban van az αS C-terminális régió erősebb kölcsönhatásával a prolinban gazdag Tau doménnel, mint a mikrotubulus-kötő doménnel, amint azt korábban leírtuk31.
Tekintettel arra, hogy a ΔNt-Tau nem tud LLPS-t végrehajtani αS hiányában, ezt a Tau-változatot választottuk modellként az αS/Tau LLPS jellemzésére, tekintettel annak egyszerűségére a teljes hosszúságú Tau-val rendelkező LLPS-rendszerekben (izotípus, Tau441/Tau441).komplex (heterotípusos, αS/Tau441) aggregációs folyamatokkal.Összehasonlítottuk az αS aggregáció mértékét (a kondenzált fázisú fehérje, az fαS,c részeként) az αS/Tau és αS/ΔNt-Tau rendszerekben centrifugálással és diszpergált fázisú SDS-PAGE analízissel (lásd 2e), és nagyon hasonló értékeket kaptunk. minden fehérjére azonos koncentrációban.Pontosabban, az αS/Tau és az αS/ΔNt-Tau esetében 84 ± 2%, illetve 79 ± 7%-os fαS,c-t kaptunk, ami arra utal, hogy az αS és a tau közötti heterotípusos kölcsönhatás jobb, mint a tau-molekulák közötti kölcsönhatás.között.
A különböző polikationokkal való kölcsönhatást és a kondenzációs folyamat αS kinetikájára gyakorolt ​​hatását először a fotofehérítés utáni fluoreszcencia-visszanyerés (FRAP) módszerével vizsgáltuk.Teszteltük az αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau és αS/pLK koacervátumokat (100 μM αS kiegészítve 2 μM αS AF488-αS és 100 μM Tau441 vagy ΔNt-MLK p or).Az adatokat a mintakomponensek összekeverése utáni első 30 percben szereztük be.A reprezentatív FRAP-képekből (3a. ábra, αS/Tau441 kondenzáció) és a hozzájuk tartozó időbeli görbékből (3b. ábra, kiegészítő 3. ábra) látható, hogy az αS kinetikája nagyon hasonló a Tau441 koacervátumokéhoz.és a ΔNt-Tau, amely sokkal gyorsabb a pLK-val.A koacervátumon belüli αS számított diffúziós együtthatói a FRAP szerint (Kang et al. 35. leírása szerint) D = 0,013 ± 0,009 µm2/s és D = 0,026 ± 0,008 µm2/s az αS/Tau441 és N t az αS/ rendszer.pLK, Tau és D = 0,18 ± 0,04 µm2/s (3c. ábra).Azonban az αS diffúziós együttható a diszpergált fázisban több nagyságrenddel magasabb az összes kondenzált fázisnál, amint azt fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiával (FCS, lásd a 3. kiegészítő ábrát) határoztuk meg, azonos körülmények között (LLPS puffer), de polikationok hiányában. (D = 8 ± 4 µm2/s).Ezért az αS transzláció kinetikája szignifikánsan lecsökken a koacervátumokban a diszpergált fázisban lévő fehérjékhez képest a kifejezett molekuláris zsúfoltsági hatások miatt, bár minden koacervátum megőrzi folyadékszerű tulajdonságait a képződést követő első fél órában, ellentétben a tau fázissal.gyorsabb kinetika pLK kondenzátumban.
a–c Az αS dinamikájának (2% AF488-mal jelölt αS) FRAP elemzése elektrosztatikus koacervátumokban.Az αS/Tau441 FRAP vizsgálatok reprezentatív képei három példányban láthatók az (a), ahol piros körök jelzik az elszíneződött területeket.A skála 5 µm.b Átlagos FRAP görbék és (c) számított diffúziós együtthatók (D) 5–6 (N) különböző cseppre három kísérletből, 100 µM αS és Tau441 (piros) vagy ΔNt-Tau (kék) vagy pLK (zöld) ekvimoláris koncentrációjával. az LLPS koncentrációjának tízszeresével.A FRAP görbe szórása árnyékolt színnel látható.Összehasonlításképpen az αS diffúziós együtthatót a diszpergált fázisban háromszor határoztuk meg fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiával (FCS) (további információért lásd a 3. kiegészítő ábrát és a módszereket).d 100 μM TEMPOL-122-αS folyamatos X-sávos EPR spektruma LLPS pufferben polikation nélkül (fekete) vagy 100 μM Tau441 (piros) vagy ΔNt-Tau (kék) vagy 1 mM pLK (zöld) jelenlétében.A betét nagyított nézetben mutatja az erős mezővonalakat, ahol a legdrámaibb változások következnek be.e 50 μM TEMPOL-122-αS kötési görbéi különféle polikationokkal LLPS hiányában (nincs PEG).A III-as sáv csökkentett amplitúdója a normalizált EPR-spektrum II-es sávjához (IIII/III) képest növeli a Tau441 (piros), ΔNt-Tau (kék) és pLK (zöld) mólarányát.A színes vonalak az adatokhoz való illeszkedést mutatják egy durva kötési modell használatával, n azonos és független kötőhellyel minden görbén.A nyers adatok nyers adatfájlok formájában állnak rendelkezésre.
Kiegészítésként az αS dinamikáját vizsgáltuk különböző koacervátumokban irányított spin-címkézés (SDSL) és folyamatos elektronparamágneses rezonancia (CW-EPR) segítségével.Ez a módszer nagyon hasznosnak bizonyult az IDP rugalmasságának és dinamikájának reális maradék felbontású jelentésében36,37,38.Ebből a célból egyetlen Cys-mutánsban cisztein-maradékokat állítottunk elő, és a 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-piperidin-N-oxil (TEMPOL) spin próbát használtuk.Maleimid származékok jelölik őket.Pontosabban, a 122. vagy 24. αS pozícióba TEMPOL szondákat helyeztünk be (TEMPOL-122-αS és TEMPOL-24-αS).Az első esetben a fehérje C-terminális régióját célozzuk meg, amely részt vesz a polikationokkal való kölcsönhatásban.Ehelyett a 24. pozíció információt nyújthat a kondenzátumban lévő fehérjék általános dinamikájáról.A diszpergált fázisú fehérjékre kapott EPR jelek mindkét esetben a gyorsan mozgó állapotú nitroxid gyököknek feleltek meg.Tau vagy pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 vagy ΔNt-Tau 1:1 arányban vagy pLK 1:10 arányban) jelenlétében végzett fázisszétválasztás után a relatív csúcsintenzitás növekedését figyelték meg az αS EPR spektruma.A veszteségvonal kiszélesedett, jelezve, hogy a cseppekben az αS reorientációs kinetikája csökken a híg fázisú fehérjéhez képest (3d. ábra, 4a. kiegészítő ábra).Ezek a változások a 122. pozícióban kifejezettebbek. Míg a 24. pozícióban a pLK jelenléte nem befolyásolta a próba kinetikáját, addig a 122. pozícióban a spektrumvonal alakja jelentősen megváltozott (4a. kiegészítő ábra).Amikor megpróbáltuk modellezni két αS/polikation rendszer 122-es pozíciójában lévő spektrumokat a spin-jelölt IDP38,39 dinamikájának leírására általánosan használt izotróp modell segítségével (5a. kiegészítő ábra), nem tudtuk rekonstruálni a kísérleti spektrumot..24 spin kontraszt helyzetének spektrális szimulációja (5a. kiegészítő ábra).Ez arra utal, hogy az αS C-terminális régiójának spin-konfigurációinak terében polikationok jelenlétében vannak preferált pozíciók.Ha figyelembe vesszük az αS frakcióját a kondenzált fázisban kísérleti EPR körülmények között (84 ± 2%, 79 ± 7%, illetve 47 ± 4% az αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau és αS/pLK esetében – lásd a Kiegészítő részt). A c) adatelemzés 2e. ábrája látható, hogy az EPR módszerrel kimutatott kiszélesedés elsősorban az αS C-terminális régiójának kölcsönhatását tükrözi a kondenzált fázisban lévő különböző polikationokkal (a fő változás a TEMPOL-122- használatakor αS), és nem fehérje kondenzáció.A szondában a mikroviszkozitás növekedése figyelhető meg.Ahogy az várható volt, a fehérje EPR-spektruma az LLPS-től eltérő körülmények között teljesen helyreállt, amikor 1 M NaCl-t adtunk a keverékhez (4b. kiegészítő ábra).Összességében adataink azt sugallják, hogy a CW-EPR által kimutatott változások főként az αS C-terminális régiójának kölcsönhatását tükrözik a különböző polikationokkal a kondenzált fázisban, és ez a kölcsönhatás erősebbnek tűnik a pLK-val, mint a Tau-val.
Annak érdekében, hogy több szerkezeti információt szerezzünk a koacervátumban lévő fehérjékről, úgy döntöttünk, hogy az LLPS rendszert NMR oldatban tanulmányozzuk.Azonban csak a diszpergált fázisban maradt αS frakciót tudtuk kimutatni, ami a koacervátumon belüli csökkent fehérjedinamika és az oldat alján lévő sűrű fázis következménye lehet az NMR analízis során.Amikor az LLPS minta diszpergált fázisában maradt fehérje szerkezetét és dinamikáját elemeztük NMR segítségével (kiegészítő 5c, d ábra), azt vettük észre, hogy a fehérje csaknem azonosan viselkedik pLK és ΔNt-Tau jelenlétében. amelyek a fehérjeváz másodlagos szerkezetében és dinamikájában voltak, amit a másodlagos kémiai eltolódás és az R1ρ relaxáció kísérletei mutattak ki.Az NMR-adatok azt mutatják, hogy az αS C-terminálisa jelentős veszteséget szenved a konformációs rugalmasságban, miközben megtartja rendezetlenségét, mint a fehérjeszekvencia többi része, a polikationokkal való kölcsönhatása miatt.
Mivel a TEMPOL-122-αS kondenzált fázisában megfigyelt CW-EPR jelszélesedés a fehérje és a polikationok kölcsönhatását tükrözi, EPR titrálást végeztünk, hogy értékeljük az αS különböző polikationokhoz való kötődési affinitását LLPS hiányában (nincs akkumuláció). LLPS puffer), ami arra utal, hogy a kölcsönhatások azonosak a híg és a koncentrált fázisban (amit adataink, a 4a kiegészítő ábra és a 6. kiegészítő ábra is megerősítenek).A cél az volt, hogy megvizsgálják, hogy az összes koacervátum, közös folyadékszerű tulajdonságai ellenére, mutat-e valamilyen mögöttes eltérő viselkedést molekuláris szinten.Ahogy az várható volt, az EPR spektrum kiszélesedett a polikationkoncentráció növekedésével, ami a molekuláris rugalmasság csökkenését tükrözi az összes interakciós partner molekuláris kölcsönhatásai miatt, majdnem a telítésig (3e. ábra, 6. kiegészítő ábra).A pLK ezt a telítettséget alacsonyabb mólarány mellett érte el (polikation:αS), mint a ΔNt-Tau és a Tau441.Valójában az adatok összehasonlítása egy hozzávetőleges kötési modellel, amely n azonos és független kötőhelyet feltételez, azt mutatta, hogy a pLK látszólagos disszociációs állandója (~5 μM) egy nagyságrenddel alacsonyabb, mint a Tau441-é vagy a ΔNt-Taué (~50 μM). ).µM).Bár ez egy durva becslés, ez arra utal, hogy az αS nagyobb affinitással rendelkezik az egyszerűbb, folyamatos pozitív töltésű régiókkal rendelkező polikationokhoz.Tekintettel az αS és a különböző polikationok közötti affinitásbeli különbségre, azt feltételeztük, hogy a folyadék tulajdonságaik idővel eltérően változhatnak, és így eltérő LSPT folyamatoktól szenvedhetnek.
Tekintettel a fehérje koacervátumon belüli rendkívül zsúfolt környezetre és a fehérje amiloid természetére, megfigyeltük a koacervátum viselkedését az idő múlásával, hogy észleljük a lehetséges LSPT folyamatokat.BF és CF mikroszkóppal (4. ábra) megfigyeltük, hogy az αS/Tau441 oldatban nagymértékben koacerválódik, nagy cseppeket képezve, amelyek a vártnak megfelelően teljes cseppként érintkeznek és nedvesítik a felületet a lyuk/csúszda alján (kiegészítő ábra 7d);ezeket az alul kialakult struktúrákat „fehérjetutajoknak” nevezzük.Ezek a struktúrák folyékonyak maradtak, mivel megőrizték összeolvadási képességüket (7b. kiegészítő ábra), és az LLPS aktiválása után több órán keresztül is láthatóak voltak (4. ábra és 7c. kiegészítő ábra).Megfigyeltük, hogy a nedvesítési folyamat a hidrofil, nem pedig a hidrofób anyagok felületén előnyös (7a. Kiegészítő ábra), amint az a kiegyensúlyozatlan töltésekkel és így magas elektrosztatikus felületi potenciállal rendelkező elektrosztatikus koacervátumok esetében várható.Nevezetesen, az αS/ΔNt-Tau koaleszcencia és rafting szignifikánsan csökkent, míg az αS/pLK kondenzátumok szignifikánsan csökkentek (4. ábra).A rövid inkubációs idő alatt az αS/pLK cseppek képesek voltak egyesülni és megnedvesíteni a hidrofil felületet, de ez a folyamat gyorsan leállt, és 5 órás inkubáció után már csak korlátozott koaleszcencia események és nedvesedés nem volt megfigyelhető.– gél-csepp átmenet.
100 µM αS-t (1% fluoreszcens jelölést) tartalmazó koacervátumminták reprezentatív BF (szürkeárnyalatos panelek) és CF (jobb oldali panelek, zölden AF488-jelzésű αS) LLPS pufferben 100 µM Tau441 (felső) mikrofluoreszcenciás képek jelenlétében -Tau (középen) vagy 1 mM pLK (alul) különböző inkubációs időkkel és fókuszmagasságokkal (z, távolság a lemez mélyedésétől).A kísérleteket 4-6 alkalommal ismételtük meg egymástól függetlenül, azonos eredménnyel.Az αS/Tau441 koacervátumok 24 óra elteltével megnedvesednek, és a képen láthatónál nagyobb tutajokat képeznek.Az összes kép méretaránya 20 µm.
Ezután megkérdeztük, hogy az αS/Tau441 LLPS-ben képződött nagy, folyadékszerű fehérjekészletek vajon a vizsgált fehérjék bármelyikének amiloid aggregációjához vezetnek-e.Az αS/Tau441 cseppek érését idővel WF mikroszkóppal követtük a fentiekkel megegyező körülmények között, de 1 μM AF488-mal jelölt αS és Atto647N-jelzett Tau441 alkalmazásával (5a. ábra).Ahogy az várható volt, teljes fehérje lokalizációt figyeltünk meg az érési folyamat során.Érdekes módon kb.5 óra elteltével intenzívebb, nem kör alakú struktúrákat figyeltünk meg a tutajok belsejében, amelyeket „pontoknak” neveztünk, amelyek egy része αS-vel kolokalizált, néhány pedig Tau441-ben gazdagodott (5a. ábra, fehér nyilak).Ezeket a foltokat mindig nagyobb mértékben figyelték meg a tutajon belül az αS/ΔNt-Tau esetében, mint az αS/ΔNt-Tau esetében.A pLK és Tau rendszerek cseppjeiben nem voltak külön foltok, amelyek nem voltak alkalmasak a fúzióra/nedvesítésre.Annak tesztelésére, hogy ezek az αS-t és Tau441-et tartalmazó foltok amiloidszerű aggregátumok-e, hasonló kísérletet végeztünk CF mikroszkóppal, amelyben a Tau441-et Atto647N-nel jelöltük, és kezdettől fogva 12,5 μM amiloid-specifikus tioflavin-T-t (ThT) adtunk hozzá.festék.Bár az αS/Tau441 cseppek vagy tutajok ThT-festődését még 24 órás inkubáció után sem figyelték meg (5b. ábra, felső sor – a maradék cseppek a fehérjetutajok felett), a tutajon belül Atto647N-Tau441-et tartalmazó ThT-pozitív szerkezetek nagyon gyengék voltak.ez megismétli a korábban leírt foltok méretét, alakját és elhelyezkedését (5b. ábra, középső és alsó sorok), ami arra utal, hogy a foltok megfelelhetnek az öregedő folyadékkoacervátumokban képződő amiloidszerű aggregátumoknak.
WF 25 μM αS különböző inkubációs időkben és fókuszmagasságokban (z, távolság a nem kötött aljtól) 25 μM Tau441 (1 μM AF488-mal jelölt αS és Atto647N-jelölt Tau441) jelenlétében egy mikroszkóp pufferlemez lyukájában LLPS-sel) .Hat kísérletet egymástól függetlenül megismételtek hasonló eredménnyel.b CF mikroszkópos képe 25 μM αS-ről 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-nel jelölt Tau441) és 12,5 μM tioflavin-T (ThT) jelenlétében.A súlyozott fehérjecseppek és a lerakódott fehérje tutajok és foltok a felső és a középső sorban láthatók.Az alsó sorban a tutajok és a vízesések képei láthatók 3 független másolatból.A fehér nyilak mindkét panelen ThT-pozitív pontokat jeleznek.Az összes kép méretaránya 20 µm.
A koacervátum fehérjehálózatban a folyékonyból szilárd állapotba való átmenet során bekövetkezett változások részletesebb vizsgálatához fluoreszcens élettartam képalkotást (FLIM) és Förster rezonancia energiatranszfer mikroszkópiát (FRET) alkalmaztunk (6. ábra és 8. és 9. kiegészítő ábra).Feltételeztük, hogy a réteg koacervátum érése kondenzáltabb vagy akár szilárd aggregált fehérjeszerkezetté szorosabb érintkezést eredményez a fehérje és a hozzá kapcsolódó fluoreszcens próba között, ami potenciálisan kioltó hatást vált ki, amely a próba élettartamának lerövidülésében (τ) nyilvánul meg. , ahogy azt korábban leírtuk40.,41 ,42.Ezenkívül a kettős jelölésű minták esetében (az AF488 és az Atto647N mint FRET donor és akceptor színezék) ez a τ csökkenés koacervátum kondenzációval és a FRET(E) hatékonyságának növekedésével is együtt járhat az LSPT során.Figyeltük a tutaj- és foltképződést az idő múlásával LLPS αS/Tau441 és αS/ΔNt-Tau mintákban (25 µM minden fehérjéből LLPS pufferben, amely 1 µM AF488-mal jelölt αS és/vagy Atto647N jelölt Tau441 vagy ΔNt-Tau).Általános tendenciát figyeltünk meg abban, hogy az AF488 (τ488) és Atto647N (τ647N) szondák fluoreszcencia élettartama enyhén csökkent a koacervátumok érésével (6. ábra és 8c. kiegészítő ábra).Érdekes módon ez a változás szignifikánsan megnövekedett a tutajokon belüli pontoknál (6c. ábra), ami azt jelzi, hogy a pontokban további fehérjekondenzáció történt.Ennek alátámasztására nem figyeltek meg szignifikáns változást a fluoreszcencia élettartamában a 24 órán át öregített αS/ΔNt-Tau cseppeknél (kiegészítő 8d. ábra), ami arra utal, hogy a cseppek gélesedése a foltosodástól eltérő folyamat, és nem jár jelentős molekuláris átrendeződés. koacervátumokon belül.Meg kell jegyezni, hogy a pontok eltérő méretűek és változó tartalmúak az αS-ben, különösen az αS/Tau441 rendszer esetében (kiegészítő 8e. ábra).A foltfluoreszcencia élettartamának csökkenését az intenzitás növekedése kísérte, különösen az Atto647N-nel jelölt Tau441 esetében (kiegészítő 8a ábra), és magasabb FRET-hatékonyság mind az αS/Tau441, mind az αS/ΔNt-Tau rendszerek esetében, ami további kondenzációt jelez az LLPS-ben öt óra alatt. triggerelés után a statikus elektromosságban lévő fehérjék lecsapódtak.Az αS/ΔNt-Tau-hoz képest alacsonyabb τ647N és valamivel magasabb τ488 értékeket figyeltünk meg az αS/Tau441 foltokban, amihez alacsonyabb és inhomogénebb FRET értékek társultak.Valószínűleg ez összefügghet azzal, hogy az αS/Tau441 rendszerben a megfigyelt és várható αS bőség az aggregátumokban heterogénebb, gyakran szubsztöchiometrikus a Tauhoz képest, mivel maga a Tau441 is áteshet LLPS-en és aggregáción (kiegészítő 8e. ábra). .Azonban a cseppek összeolvadásának, a tutajképződésnek és – ami fontos – a fehérje-aggregációnak a mértéke a folyadékszerű koacervátumokon belül maximális, ha Tau441 és αS is jelen van.
Élettartamú fluoreszcens mikroszkópos (FLIM) felvételek az αS/Tau441-ről és az αS/ΔNt-Tau-ról 25 μM mindegyik fehérjénél (1 μM AF488-mal jelölt αS és 1 μM Atto647N-jelölt Tau441 vagy ΔNt-buuffer) in.Az oszlopok reprezentatív képeket mutatnak be az LLPS mintákról különböző érlelési időkben (30 perc, 5 óra és 24 óra).A piros keret az αS/Tau441 foltokat tartalmazó régiót mutatja.Az élettartamok színes sávokként jelennek meg.Skálasáv = 20 µm minden képnél.b A kiválasztott terület nagyított FLIM képe, amely az a panel piros mezőjében látható.Az élettartam-tartományok ugyanazzal a színskálával jelennek meg, mint az a panelen.Skálasáv = 5 µm.c Az AF488-at (az αS-hez kötve) vagy az Atto647N-t (Tau-hoz kapcsolva) mutató hisztogramok különböző fehérjefajtákra (cseppek-D-, tutaj-R- és petty-P), amelyeket az αS-re rögzített FLIM-képeken azonosítottak, a Tau441 és a Tau441 élettartama időbeli eloszlása αS/ΔNt-Tau koacervált minták (N = 17-32 ROI a D, 29-44 ROI R és 21-51 ROI a pontok esetében).Az átlagos és medián értékek sárga négyzetek, illetve fekete vonalak formájában jelennek meg a dobozokon belül.A négyzet alsó és felső határa az első és a harmadik kvartilist jelöli, a 1,5-szeres interkvartilis tartományon (IQR) belüli minimális és maximális értékek pedig bajuszként jelennek meg.A kiugró részek fekete gyémántként jelennek meg.Az eloszláspárok közötti statisztikai szignifikancia meghatározása kétmintás t-próbával történt, egyenlőtlen varianciákat feltételezve.A kétirányú t-teszt p-értékei csillaggal vannak feltüntetve minden egyes összehasonlított adatpárnál (* p-érték > 0,01, ** p-érték > 0,001, *** p-érték > 0,0001, **** p-érték > 0,00001), ns Elhanyagolhatóságot jelez (p-érték > 0,05).A pontos p értékeket az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza, az eredeti adatok pedig nyers adatfájlokként jelennek meg.
A foltok/aggregátumok amiloidszerű jellegének további bizonyítására a festetlen koacervátum mintákat 24 órán át magas koncentrációjú (1 M) NaCl-dal kezeltük, ami az aggregátumok elválasztását eredményezte a fehérje koacervátumoktól.Amikor izolált aggregátumokat (az aggregátumok diszpergált oldatát) atomi erőmikroszkóppal (AFM) figyeltük meg, túlnyomórészt gömb alakú morfológiát figyeltünk meg, szabályos körülbelül 15 nm magassággal, amely hajlamos asszociálni magas sókoncentráció körülményei között, hasonlóan a tipikus amiloid fibrillumok viselkedése a felületen kifejtett erős hidrofób hatás miatt (megjegyezzük, hogy a fibrillumok általában ~10 nm magasságúak) (kiegészítő 10a. ábra).Érdekes módon, amikor az izolált aggregátumokat ThT-vel inkubáltuk egy standard ThT fluoreszcencia vizsgálatban, drámai növekedést figyeltünk meg a ThT fluoreszcencia kvantumhozamában, ami összehasonlítható azzal, amit akkor tapasztaltunk, amikor a festéket tipikus αS amiloid fibrillákkal inkubáltuk (kiegészítő 10b ábra), ami arra utal, hogy a koacervátum aggregátumok amiloidszerű struktúrákat tartalmaznak..Valójában az aggregátumok toleránsak voltak a magas sókoncentrációkkal szemben, de érzékenyek a 4 M guanidin-kloridra (GdnHCl), mint a tipikus amiloid fibrillák (kiegészítő 10c. ábra).
Ezt követően elemeztük az aggregátumok összetételét egymolekulás fluoreszcenciával, specifikus fluoreszcencia korrelációs/keresztkorrelációs spektroszkópiával (FCS/FCCS), valamint kétszín-koincidencia detektálás (TCCD) burst elemzésével.Ebből a célból 100 μl αS-t és Tau441-et (mindkettő 25 μM) tartalmazó LLPS mintákban 24 órás inkubáció után keletkezett aggregátumokat izoláltunk 1 μM AF488-mal jelölt αS-vel és 1 μM Atto647N-jelzett Tau441N-nel együtt.Hígítsa fel a kapott diszpergált aggregátum oldatot monomolekuláris állapotra ugyanazzal a PEG-mentes pufferrel és 1 M NaCl-dal (ugyanaz a puffer, amelyet az aggregátumok koacervátumtól való elválasztására használnak), hogy megakadályozzák az LLPS és a fehérje közötti esetleges elektrosztatikus kölcsönhatásokat.Egyetlen molekula időbeli pályájára egy példa látható a 7a. ábrán.Az FCCS/FCS analízis (keresztkorreláció, CC és autokorreláció, AC) azt mutatta, hogy αS-t és tau-t tartalmazó aggregátumok bőségesek voltak a mintákban (lásd a CC-görbét a 7b. ábrán, bal oldali panelen), és a maradék monomer fehérje feleslege keletkezett a mintákban. a hígítási folyamat eredménye (lásd az AC görbéket a 7b. ábra bal oldali paneljén).Az azonos oldatkörülmények között, csak monomer fehérjéket tartalmazó mintákkal végzett kontrollkísérletek nem mutattak CC görbét, és az AC görbék jól illeszkednek az egykomponensű diffúziós modellhez (4. egyenlet), ahol a monomer fehérjék a várt diffúziós együtthatókkal rendelkeznek (7b. ábra). ), jobb oldali panel).Az aggregált részecskék diffúziós együtthatója kisebb, mint 1 µm2/s, a monomer fehérjéké pedig körülbelül 1 µm2/s.50–100 µm/s;az értékek hasonlóak az ultrahanggal kezelt αS amiloid fibrillák és a monomer αS külön-külön, hasonló oldatkörülmények között korábban közzétett értékeihez44.Amikor az aggregátumokat TCCD robbanásvizsgálattal elemeztük (7c. ábra, felső panel), azt találtuk, hogy minden izolált aggregátumban (αS/Tau heteroaggregátum) a detektált aggregátumok körülbelül 60%-a tartalmazott αS-t és tau-t is, körülbelül 30%-a csak tau, csak körülbelül 10% αS.Az αS/Tau heteroaggregátumok sztöchiometrikus analízise azt mutatta, hogy a legtöbb heteroaggregátum tauban dúsult (a sztöchiometria 0,5 alatti, a tau molekulák átlagos száma aggregátumonként 4-szer több, mint az αS molekuláké), ami összhangban van a FLIM-ben in situ megfigyelt munkánkkal. kísérletek..A FRET elemzés kimutatta, hogy ezek az aggregátumok mindkét fehérjét tartalmazták, bár a tényleges FRET értékek ebben az esetben nem nagy jelentőséggel bírnak, mivel a fluoroforok eloszlása ​​az egyes aggregátumokban véletlenszerű volt a kísérletben használt jelöletlen fehérje felesleg miatt.Érdekes módon, amikor elvégeztük ugyanazt az elemzést a 45,46 érett amiloid aggregáció-hiányos Tau-variánssal (lásd a 11a, b kiegészítő ábrát), észrevettük, hogy bár az αS elektrosztatikus aggregáció ugyanaz volt (kiegészítő 11c, d ábra), a koacervátumon belüli aggregátumképző képesség drasztikusan csökkent, és a FLIM számos foltot észlelt in situ kísérletekben, és gyenge keresztkorrelációs görbéket figyeltek meg az izolált aggregált mintákon.Azonban néhány kimutatott aggregátum esetében (a Tau441-nek csak egytizede) megfigyeltük, hogy minden aggregátum αS-ben gazdag volt, mint ez a Tau-változat, a kimutatott aggregátumok körülbelül 50%-a csak αS-molekulákat tartalmazott, és az αS feleslegben heterogén volt. .aggregátumok (lásd a 11e. kiegészítő ábrát), ellentétben a Tau441 által generált heterogén aggregátumokkal (6f. ábra).Ezen kísérletek eredményei azt mutatták, hogy bár maga az αS képes a tau-val együtt felhalmozódni a koacervátumon belül, a tau-magképződés ilyen körülmények között kedvezőbb, és az így létrejövő amiloidszerű aggregátumok képesek az αS és tau egy formájaként működni.Ha azonban egy tau-dús mag kialakul, az αS és tau közötti heterotípusos kölcsönhatások előnyben részesülnek az aggregátumokban a tau-molekulák közötti homotípusos kölcsönhatásokkal szemben;fehérjehálózatokat is megfigyelünk folyékony αS/tau koacervátumokban.
a αS/Tau441 elektrosztatikus koacervátumokban képződött izolált aggregátumok egyedi molekuláinak reprezentatív fluoreszcencia időbeli nyomai.Az αS/Tau441 koaggregátumoknak megfelelő burst (a jelzett küszöb feletti robbanások) három detektálási csatornában (AF488 és Atto647N emisszió közvetlen gerjesztés után, kék és piros vonalak, Atto647N emisszió közvetett gerjesztés után), FRET, lila vonal) figyeltek meg.b LLPS-ből nyert izolált αS/Tau441 aggregátumok mintájának FCS/FCCS elemzése (bal oldali panel).Az AF488 és Atto647N autokorrelációs (AC) görbéi kékkel, illetve pirossal, a mindkét színezéket tartalmazó aggregátumokhoz kapcsolódó keresztkorrelációs (CC) görbéket lilával mutatjuk be.Az AC görbék a jelölt monomer és aggregált fehérjefajták jelenlétét tükrözik, míg a CC görbék csak a kettős jelölésű aggregátumok diffúzióját mutatják.Ugyanaz az elemzés, de ugyanolyan oldatkörülmények között, mint az izolált foltokban, a csak monomer αS-t és Tau441-et tartalmazó minták kontrollként jelennek meg a jobb oldali panelen.c αS/Tau441 elektrosztatikus koacervátumokban képződött izolált aggregátumok egyes molekuláinak fluoreszcens flash analízise.A négy különböző ismétlésben (N = 152) talált egyes aggregátumokra vonatkozó információkat a sztöchiometriájuk, az S-értékeik és a FRET-hatékonyságuk függvényében ábrázoljuk (a felső panel, a színsáv tükrözi az előfordulást).Háromféle aggregátum különböztethető meg: -αS-csak aggregátumok S~1 és FRET~0, Tau-csak S~0 és FRET~1 aggregátumok, valamint heterogén Tau/αS aggregátumok köztes S-vel és FRET-tel A mennyiség becslései Az egyes heterogén aggregátumokban kimutatott mindkét marker fehérje (N = 100) az alsó panelen látható (a színskála tükrözi az előfordulást).A nyers adatok nyers adatfájlok formájában állnak rendelkezésre.
A folyékony fehérje kondenzátumok érése vagy öregedése gélszerű vagy szilárd szerkezetekké az idő múlásával a kondenzátum számos fiziológiai funkciójában47, valamint betegségekben is szerepet játszik, mint amiloid aggregációt megelőző abnormális folyamat 7, 48, 49. részletesen tanulmányozzuk a fázisszétválasztást és a viselkedést.LSPT αS véletlenszerű polikationok jelenlétében ellenőrzött környezetben, alacsony mikromoláris koncentrációban és fiziológiailag releváns körülmények között (megjegyezzük, hogy az αS számított fiziológiai koncentrációja >1 µM50), az LPS tipikus termodinamikailag vezérelt viselkedését követve.Azt találtuk, hogy az αS, amely fiziológiás pH-n egy erősen negatív töltésű C-terminális régiót tartalmaz, képes fehérjében gazdag cseppeket képezni vizes oldatban LLPS-en keresztül erősen kationos rendezetlen peptidek, például pLK vagy Tau jelenlétében az elektrosztatikus folyamat révén. komplex kondenzáció aggregációs makromolekulák jelenlétében.Ennek a folyamatnak jelentős hatásai lehetnek a sejtkörnyezetben, ahol az αS különböző polikationos molekulákkal találkozik, amelyek a betegséggel összefüggő aggregációjához kapcsolódnak mind in vitro, mind in vivo51, 52, 53, 54.
Számos tanulmányban a cseppekben lévő fehérjék dinamikáját az érési folyamatot meghatározó egyik kulcstényezőnek tekintették55,56.Az elektrosztatikus αS polikationokkal való koacervációiban az érési folyamat nyilvánvalóan a polikationokkal való kölcsönhatás erősségétől, a vegyértéktől és ezen kölcsönhatások sokaságától függ.Az egyensúlyelmélet azt sugallja, hogy két folyékony halmazállapotú egyensúlyi helyzet egy nagy, biopolimerekben gazdag csepp jelenléte lenne, amelyek az LLPS-t vezérlik57,58.A cseppnövekedés Ostwald érlelésével59, összeolvadással60 vagy a diszpergált fázisban lévő szabad monomer fogyasztásával érhető el61.Az αS és Tau441, ΔNt-Tau vagy pLK esetében a fehérje nagy része a kondenzátumban koncentrálódott a vizsgálatban alkalmazott körülmények között.Míg azonban a teljes méretű tau-cseppek gyorsan egyesültek a felületi nedvesítés hatására, a cseppek összeolvadása és nedvesedése nehéz volt a ΔNt-Tau és a pLK esetében, ami arra utal, hogy ebben a két rendszerben a folyadék tulajdonságai gyorsan elvesztek.FLIM-FRET analízisünk szerint az elöregedett pLK és ΔNt-Tau cseppek hasonló mértékű fehérje aggregációt (hasonló fluoreszcencia élettartam) mutattak, mint az eredeti cseppek, ami arra utal, hogy az eredeti fehérjehálózat megmaradt, bár merevebb.
Kísérleti eredményeinket a következő modellben racionalizáljuk (8. ábra).A kezdetben átmenetileg kialakuló cseppek gyakran elektrosztatikus kompenzáció nélküli fehérjehálózatok, így különösen a cseppek határfelületén vannak töltéskiegyensúlyozatlansági területek, ami nagy elektrosztatikus felületi potenciállal rendelkező cseppeket eredményez.A töltés kompenzálására (ezt a jelenséget általában vegyértékcsökkenésnek nevezik) és a cseppek felületi potenciáljának minimalizálása érdekében a cseppek tartalmazhatnak új polipeptideket a híg fázisból, átszervezhetik a fehérjehálózatokat a töltés-töltés kölcsönhatások optimalizálása érdekében, és kölcsönhatásba léphetnek más cseppekkel.felületekkel (nedvesítés).Az αS/pLK cseppek egyszerűbb fehérjehálózatuk (az αS és a pLK között csak heterotípusos kölcsönhatások) és a fehérje-fehérje kölcsönhatások iránti nagyobb affinitásuk miatt úgy tűnik, hogy gyorsabban képesek egyensúlyba hozni a kondenzátum töltését;Valójában gyorsabb fehérjekinetikát figyeltünk meg a kezdetben kialakult αS/pLK koacervátumokban, mint az αS/Tau-ban.A vegyérték kimerülése után a kölcsönhatások kevésbé múlékonyak, és a cseppek elveszítik folyékony tulajdonságaikat, és gélszerű, nem gyúlékony cseppekké alakulnak, amelyek alacsony elektrosztatikus felületi potenciállal rendelkeznek (ezért nem tudják nedvesíteni a felületet).Ezzel szemben az αS/Tau cseppek kevésbé hatékonyan optimalizálják a csepptöltés egyensúlyát a bonyolultabb fehérjehálózatok (mind homotípusos, mind heterotípusos kölcsönhatásokkal) és a fehérje kölcsönhatások gyengébb természete miatt.Ez olyan cseppeket eredményez, amelyek hosszabb ideig megtartják a folyékony viselkedést, és nagy elektrosztatikus felületi potenciált mutatnak, amelyet az összeolvadás és a növekedés minimálisra csökkent (így minimalizálva a cseppek felület/térfogat arányát) és a hidrofil felületi kémiai nedvesítéssel.Ez nagy koncentrált fehérjekönyvtárakat hoz létre, amelyek megtartják a folyadék tulajdonságait, mivel a kölcsönhatások nagyon átmenetiek maradnak a fehérjehálózatban a töltésoptimalizálás folyamatos keresése miatt.Érdekes módon a Tau N-terminálisán csonkolt formái, beleértve néhány természetben előforduló izoformát62, köztes viselkedést mutatnak, és egyesek koacerválják az αS-vel való öregedést hosszú élettartamú gélszerű cseppekké, míg mások nagy folyékony kondenzátumokká alakulnak.Az αS elektrosztatikus koacervátumok érésének ez a kettőssége összhangban van a közelmúltban végzett LLPS elméleti és kísérleti tanulmányokkal, amelyek összefüggést azonosítottak a vegyértékcsökkenés és a kondenzátum elektrosztatikus szitálása között, amely kulcsfontosságú a kondenzátum méretének és a folyadék tulajdonságainak szabályozásában.Mechanizmus 58.61.
Ez a séma az αS és Tau441 feltételezett amiloid aggregációs útvonalát mutatja be LLPS-en és LSPT-n keresztül.További anionban gazdag (piros) és kationban gazdag (kék) régiókkal a kielégítő vegyértékkel rendelkező αS és tau elektrosztatikus koacervátumok alacsonyabb felületi energiával rendelkeznek, és ezért kisebb az összeolvadás, ami a cseppek gyors öregedését eredményezi.Stabil, nem agglomerált gél állapot érhető el..Ez a helyzet az αS/pLK rendszer esetében igen kedvező a nagyobb affinitása és az egyszerűbb fehérje-pár interakciós hálózat miatt, ami gyors gélszerű átmenetet tesz lehetővé.Éppen ellenkezőleg, a nem kielégítő vegyértékű cseppek, és ezért a kölcsönhatáshoz rendelkezésre álló fehérje töltésű régiók megkönnyítik a koacervátum összeolvadását és nedvesítését a hidrofil felületen, hogy csökkentsék annak nagy felületi energiáját.Ez a helyzet előnyösebb az αS/Tau441 koacervátumok esetében, amelyek többértékű komplex hálózattal rendelkeznek, amely gyenge Tau-Tau és αS-Tau kölcsönhatásokból áll.A nagyobb koacervátumok viszont könnyebben megőrzik folyadékszerű tulajdonságaikat, lehetővé téve más fehérje-fehérje kölcsönhatások létrejöttét.Végül a koacervátum folyadékban αS-t és tau-t egyaránt tartalmazó amiloid heterogén aggregátumok képződnek, amelyek rokonságban állnak a zárványtestekben találhatóakkal, amelyek a neurodegeneratív betegségek jellemzői.
Az αS/Tau441 érése során kialakuló nagy folyadékszerű struktúrák erősen zsúfolt, de dinamikus fehérjekörnyezet mellett, és kisebb mértékben az αS/ΔNt-Tau koacervátumok ideális tárolók a fehérjeaggregáció magképződéséhez.Valóban megfigyeltük szilárd fehérje-aggregátumok képződését az ilyen típusú fehérje-koacervátumokban, amelyek gyakran αS-t és tau-t is tartalmaznak.Kimutattuk, hogy ezeket a heteroaggregátumokat nem elektrosztatikus kölcsönhatások stabilizálják, ugyanúgy képesek megkötni az amiloid-specifikus ThT festékeket, mint a tipikus amiloid fibrillumok, és valóban hasonló ellenállást mutatnak a különböző hatásokkal szemben.Az LLPS által képzett αS/tau aggregátumokról kimutatták, hogy amiloidszerű tulajdonságokkal rendelkeznek.Valójában az amiloid aggregációban hiányos Tau érett változata jelentősen károsodott ezen heterogén αS aggregátumok képződésében a folyékony elektrosztatikus koacervátumban.αS/Tau441 aggregátumok képződését csak a folyadékszerű tulajdonságokat megőrző koacervátumokon belül figyeltük meg, és soha, ha a koacervátumok/cseppek nem értek el gél állapotot.Utóbbi esetben az elektrosztatikus kölcsönhatások megnövekedett ereje és ennek eredményeként a fehérjehálózat merevsége megakadályozza a fehérjék szükséges konformációs átrendeződését az amiloid nukleációhoz szükséges új fehérjekölcsönhatások kialakításához.Ez azonban rugalmasabb, folyadékszerű koacervátumokkal érhető el, amelyek viszont nagyobb valószínűséggel maradnak folyékonyak a méretük növekedésével.
Az a tény, hogy az aggregátumok képződése a kondenzált fázisban előnyösebb a nagy αS/Tau kondenzátumokban, mint a gyorsan gélesedő kis cseppekben, rávilágít a cseppek összeolvadását szabályozó tényezők azonosításának fontosságára.Így nemcsak a fázisszétválasztásra van tendencia, hanem a kondenzátum méretét is ellenőrizni kell a megfelelő működéshez, valamint a betegségek megelőzéséhez58,61.Eredményeink rávilágítanak az LLPS és az LSPT közötti egyensúly fontosságára is az αS/Tau rendszerben.Míg a cseppek képződése megvédhet az amiloid aggregációtól azáltal, hogy csökkenti a telítési körülmények között elérhető fehérjemonomerek mennyiségét, amint azt más rendszerekben javasolták63, 64, a cseppek magas cseppszintű fúziója lassú konformációs átrendeződések révén belső fehérje aggregációhoz vezethet.fehérje hálózatok..
Összességében adataink erősen hangsúlyozzák a kohéziós vegyérték és az elégedett/elégedetlen interakciók relevanciáját a csepphálózatokban az LSPT összefüggésében.Különösen azt mutatjuk be, hogy a teljes hosszúságú αS/Tau441 kondenzátumok képesek hatékonyan fuzionálni és magképződni, amiloidszerű heteroaggregátumokat képezve, amelyek mindkét fehérjét tartalmazzák, és kísérleti eredményeink alapján molekuláris mechanizmust javasolnak.Két fehérje együttes aggregációja az αS/Tau folyadékkoacervátumban, amelyről itt beszámolunk, valóban összefüggésbe hozható két fehérje együttes lokalizációjával a zárványokban, amelyek a betegség jellemzői, és hozzájárulhatnak az LLPS és az LLPS közötti kapcsolat megértéséhez. amiloid aggregáció, megnyitva az utat a magas töltésű IDP számára a neurodegenerációban.
A monomer WT-αS, cisztein mutánsok (Q24C-αS, N122C-αS) és ΔCt-αS variánsok (Δ101-140) expresszáltattuk E. coliban, és a korábban leírtak szerint tisztítottuk.Az αS cisztein mutánsok tisztításának minden lépésében 5 mM DTT-t alkalmaztunk, hogy megakadályozzuk a diszulfid kötés kialakulását.Tau441 izoforma (az Addgene #16316-ból nyert plazmid), ΔNt-Tau variáns (Δ1–150, IVA klónozásával nyert CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) és AggDEf1-2CT55 primerrel tisztított (G3Δ1-2CTTamer) E. coli tenyészetek voltak OD600 = 0,6-0,7 értékre nőtt 37 °C-on és 180 rpm-en, és az expressziót IPTG-vel indukáltuk 3 órán át 37 °C-on.Gyűjtsük össze a sejteket 11 500 xg-vel 15 percig 4 °C-on, és mossuk 150 mM NaCl-ot tartalmazó sóoldattal.Szuszpendálja újra a pelletet lízispufferben (20 ml per 1 liter LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidin 50 μM, 00 copeptin1 M).Az ultrahangos kezelési lépést jégen hajtottuk végre 80%-os amplitúdóval 10 impulzuson keresztül (1 perc bekapcsolva, 1 perc kikapcsolva).Egy ultrahangon ne haladja meg a 60 ml-t.Az E. coli lizátumokat 95 °C-on 20 percig melegítettük, majd jégen lehűtöttük, és 127 000 x g-vel 40 percig centrifugáltuk.A megtisztított felülúszót 3,5 kDa-os membránra vittük fel (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Egyesült Királyság), és 4 liter dialízispufferrel (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM) szemben dializáltuk. PMSF 0,1 mM) 10 órán át.Egy 5 ml-es kationcserélő oszlopot (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ekvilibráló pufferrel (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF) ekvilibráltunk.A tau-lizátumot 0,22 μm-es PVDF szűrőn átszűrtük, és 1 ml/perc áramlási sebességgel az oszlopba injektáltuk.Az eluálást fokozatosan végeztük, a tau-t 15-30%-os elúciós pufferrel (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF) eluáltuk.A frakciókat SDS-PAGE-val elemeztük, és minden olyan frakciót, amely egy sávot tartalmazott a tau várható molekulatömegével, 10 kDa-os centrifugaszűrő segítségével koncentráltuk, és 10 mM HEPES-t (pH 7,4, NaCl 500 mM és DTT 2 mM DTT) tartalmazó pufferrel helyettesítettük. a végső fehérjekoncentráció 100 μM volt.A fehérjeoldatot ezután 0,22 μm-es PVDF szűrőn engedtük át, gyorsan lefagyasztottuk és -80 °C-on tároltuk.A K18 fehérjét Prof. Alberto Boffi biztosította.A készítmény tisztasága >95% volt, amint azt SDS-PAGE és MALDI-TOF/TOF igazolta.Különféle ciszteineket kémiailag jelöltünk AlexaFluor488-maleimiddel (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) vagy TEMPOL-maleimiddel (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).abszorbancia és MALDI-TOF/TOF igazolták.A Tau441-et, a ΔNt-Tau-t, az AggDef-Tau-t és a K18-at natív cisztein-maradékokkal jelöltük a 191. és 322. pozícióban, Atto647N-maleimidet (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Németország) alkalmazva ugyanezt az eljárást követve.A maradékonkénti nettó töltési térképeket az αS és a Tau441 esetében a CIDER66 segítségével állítottuk elő.
Szilárd poli-L-lizint (pLK DP 90-110 NMR szerint a szállítótól, az Alamanda Polymers Inc., Huntsville, Alabama, USA) 10 mM HEPES-ben, 100 mM NaCl-ban, pH 7,4-10 mM koncentrációban oldottuk, az eljárást 5 percig ultrahanggal kezeltük. percig ultrahangos vízfürdőben, és -20°C-on tároljuk.A PEG-8, dextrán-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) és FITC-dextrán-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) vízben oldódnak és széles körben elterjedtek az LLPS pufferben.A dialízis eltávolítja a szennyező sókat.Ezután 0,22 μm pórusméretű fecskendőszűrőn átszűrtük, és koncentrációjukat refraktométerrel (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA) számítottuk ki.Az LLPS mintákat szobahőmérsékleten a következő sorrendben állítottuk elő: a puffert és az extrudálást összekevertük, és 1 mM trisz(2-karboxi-etil)-foszfint (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etán- 1,2-diildinitril) tetraecetsav (EDTA, karboxint) és 1%-os proteázgátló (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptin 5 μM) keveréke.Ezután hozzáadjuk az αS-t és a fuzionált polikationokat (opciók pLK vagy Tau).A tioflavin-T idősoros kísérletekhez (ThT, Carbosynth, Compton, Egyesült Királyság) használja a teljes ThT-koncentrációt az αS-koncentráció felére.Óvatosan, de alaposan keverje össze a mintákat, hogy homogének legyenek.Az egyes komponensek koncentrációja kísérletenként változott, az Eredmények részben leírtak szerint.Azidot 0,02% (w/v) koncentrációban alkalmaztuk, ha a kísérlet időtartama meghaladta a 4 órát.Minden LLPS-mintát használó elemzésnél hagyja, hogy a keverék 5 percig kiegyensúlyozódjon az elemzés előtt.A fényszórási analízishez 150 µl mintát nem kötõdõ 96 lyukú mikrolemezekre (µClear®, fekete, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Ausztria) töltöttünk, és ragasztófóliával fedtük le.Az LLP-ket az oldat közepén 350 nm-en mért abszorbancia mérésével követtük CLARIOstar lemezleolvasóval (BMG Labtech, Ortenberg, Németország).A kísérleteket három párhuzamosban hajtottuk végre 25°C-on, és a hibákat az átlagtól való szórásként számítottuk ki.A híg fázis mennyiségét minta centrifugálásával és SDS-PAGE gél analízissel határoztuk meg, az αS frakciót pedig a híg és a koncentrált fázisban különböző LLPS oldatokban határoztuk meg.Alapos keveréssel, majd 9600 × g-vel 30 percig tartó centrifugálással 100 μl-es LLPS mintát állítottunk elő, amely 1 μM AF488-jelzett αS-t tartalmazott, ami után a csapadék általában látható volt.A felülúszó felső 50 μl-ét használtuk fel a fehérje mennyiségi meghatározására SDS-PAGE gél segítségével.A géleket AF488 szűrőkkel szkenneltük ChemiDoc gél képalkotó rendszerrel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), vagy Coomassie festéssel festettük, és megfelelő szűrőkkel tettük láthatóvá.A kapott sávokat az ImageJ 1.53i verziójával (National Institutes of Health, USA) elemeztük.A kísérleteket két párhuzamosban végeztük, két különböző kísérletben, hasonló eredménnyel.
Általában 150 μl mintát vittek fel nem kötődő 96 lyukú mikrolemezekre, és szobahőmérsékleten egy Leica DMI6000B fordított mikroszkóppal (Leica Microsystems, Wetzlar, Németország) tettük láthatóvá.A pontkísérletekhez µ-Slide Angiogenesis lemezeket (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Németország) vagy 96 lyukú polisztirol mikrolemezeket (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) is használtunk.EL6000 halogén vagy higany fémhalogén lámpákat használtak megvilágítási forrásként (a BF/DIC, illetve a WF képalkotáshoz).A WF mikroszkópiához 40-szeres nagyítású levegőobjektívet (Leica Microsystems, Németország) használtak a fény mintára fókuszálására és összegyűjtésére.Az AF488-as és ThT-jelölésű mintáknál a gerjesztés és emisszió szűrése szabványos GFP szűrőkészletekkel, gerjesztési és emissziós sáváteresztő szűrőkkel, 460–500 nm-es, illetve 512–542 nm-es sávszűrőkkel és 495 nm-es dikroikus tükörrel.Az Atto647N-nel jelölt mintákhoz egy szabványos Cy5 szűrőkészletet használtak 628–40 nm-es, illetve 692–40 nm-es gerjesztési és emissziós sávszűrőkkel, valamint egy 660 nm-es dikroikus tükröt.A BF és DIC mikroszkópiához ugyanazt a visszavert fénygyűjtő objektívet használja.Az összegyűjtött fényt Leica DFC7000 CCD kamerán (Leica Microsystems, Németország) rögzítettük.Az expozíciós idő 50 ms volt BF és DIC mikroszkópos képalkotásnál, és 20-100 ms WF mikroszkópos képalkotásnál.Összehasonlításképpen az expozíciós idő minden ThT-vel végzett kísérletben 100 ms volt.Időzített kísérleteket végeztek a cseppek összeolvadásának megjelenítésére, a képeket 100 ms-onként gyűjtötték néhány percig.Az ImageJ (NIH, USA) képelemzést használtuk.A kísérleteket három párhuzamosban végeztük, hasonló eredménnyel.
A kolokalizációs kísérletekhez, a FRAP-hoz és a 3D rekonstrukcióhoz a képeket Zeiss LSM 880 fordított konfokális mikroszkóppal készítettük, ZEN 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Németország) segítségével.Az 50 µl-es mintákat µ-Slide Angiogenesis Petri-csészékre (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Németország) vittük fel, hidrofil polimerrel (ibiTreat) kezeltük, és 63× olajimmerziós objektívre (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) rögzítettük. a DIC-en).A képeket 458 nm-es, 488 nm-es és 633 nm-es argon lézervonalak segítségével készítettük 0,26 µm/pixel felbontással és 8 µs/pixel expozíciós idővel a 470-600 nm-es gerjesztési és emissziós észlelési ablakokhoz, 493-628 nm és 638–755 nm-t használtunk a ThT, az AF488 és az Atto647N megjelenítésére.A FRAP-kísérletekhez az egyes minták időzített fényképezését másodpercenként 1 képkocka sebességgel rögzítettük.A kísérleteket három párhuzamosban végeztük szobahőmérsékleten, hasonló eredménnyel.Minden képet Zen 2 blue edition szoftverrel elemeztünk (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Németország).A FRAP-görbéket normalizáltuk, ábrázoltuk, és a Zen 2 segítségével, az OriginPro 9.1 segítségével a képekből kinyert intenzitás/idő adatokhoz illesztettük.A visszanyerési görbéket monoexponenciális modellre illesztettük, hogy figyelembe vegyük a molekuláris diffúziót egy további exponenciális taggal, hogy figyelembe vegyük a fehérítő hatást.Ezután kiszámítottuk a D-t a névleges fehérítési sugár és a korábban meghatározott visszanyerési felezési idő felhasználásával, a Kang és munkatársai egyenletének megfelelően.5 35 látható.
Az αS egyes ciszteinváltozatait 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-piperidin-N-oxil-dal (TEMPOL) szintetizálták a 24-es (TEMPOL-24-αS) és a 122-es (TEMPOL-122-αS) pozíciókban, illetőleg.Spin jelölés Az EPR-kísérletekhez az αS koncentrációt 100 μM-ra, a PEG-koncentrációt 15%-ra (w/v) állítottuk be.Különféle aggregációs körülmények között az αS:pLK arány 1:10 volt, míg az αS:ΔNt-Tau és αS:Tau441 arány 1:1 volt.A zsúfoltság hiányában végzett kötődési titrálási kísérletekhez a TEMPOL-122-αS-t 50 μM-on tartottuk, és a polikationokat növekvő koncentrációban titráltuk, minden egyes állapotot külön előkészítve.A CW-EPR méréseket Bruker ELEXSYS E580 X-band spektrométerrel végeztük, amely Bruker ER4118 SPT-N1 rezonátorral volt felszerelve, ~9,7 GHz-es mikrohullámú (SHF) frekvencián.A hőmérsékletet 25 °C-ra állítottuk be, és folyékony nitrogénes kriosztáttal szabályoztuk.A spektrumokat telítetlen körülmények között, 4 mW MW teljesítménnyel, 0,1 mT modulációs amplitúdóval és 100 kHz modulációs frekvenciával kaptuk.A spektrális intenzitást normalizáltuk, hogy elkerüljük a minták közötti spin-koncentrációk különbségeit, valamint a Tau441-et vagy ΔNt-Tau-t (az eredeti fehérjeoldatokban jelenlévő) tartalmazó mintákban a redukálószerek maradék koncentrációja miatti lehetséges spin-csökkenést.A megadott g értékeket a Matlab®67-be implementált Easyspin szoftverrel (v. 6.0.0-dev.34) végrehajtott EPR spektrális modellezés eredményeként kaptuk.Az adatok modellezésére egy/két komponensű izotróp modelleket használtunk.Az összes jel normalizálása után a maradékokat úgy számítottuk ki, hogy minden szimulációt kivontunk a megfelelő kísérleti spektrumból.A kötődési titrálási analízishez a harmadik sáv relatív intenzitását a normalizált EPR spektrum második sávjához (IIII/III) használtuk a polikationok αS-hez való kötődésének monitorozására.A disszociációs állandó (Kd) becsléséhez a kapott görbét egy közelítő modellre illesztettük, amely n azonos és független kötőhelyet feltételez.
Az NMR-spektroszkópiás kísérleteket egy kriopróbával és Z-gradienssel felszerelt Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spektrométerrel végeztük.Minden kísérletet 130-207 µM αS és a megfelelő αS/ΔNt-Tau és pLK ekvivalensek felhasználásával végeztünk 10 mM HEPES-ben, 100 mM NaCl-ban, 10% DO-ban, pH 7,4, és 15 °C-on végeztük.Az LPS NMR-vizsgálatához 10% PEG-et adtunk az előkevert mintákhoz.A kémiai eltolódás perturbációs görbéje (1b. ábra) az átlagos 1H és 15N kémiai eltolódásokat mutatja.Az αS 2D1H-15N HSQC spektrumokat egy korábbi hozzárendelés alapján (BMRB bejegyzés #25227) jelöltük ki, és a HNCA, HNCO és CBCAcoNH 3D spektrumának rögzítésével és elemzésével erősítették meg.A 13Cα és 13Cβ kémiai eltolódásokat ΔNt-Tau vagy pLK jelenlétében számítottuk ki, hogy mérjük a másodlagos szerkezeti tendenciák lehetséges változásait az αS kémiai eltolódásokhoz képest a tiszta véletlenszerű tekercs konformációjában 68 (5c. kiegészítő ábra).Az R1ρ sebességeket hsqctretf3gpsi kísérletek (a Bruker könyvtárból nyert) rögzítésével mértük 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 és 800 ms késleltetéssel, és az exponenciális függvényeket a különböző intenzitású csúcskésésekhez igazították. időt az R1ρ és kísérleti bizonytalanságának meghatározásához.
A kétszínű időfelbontású fluoreszcens mikroszkópos kísérleteket kereskedelmi forgalomban kapható időfelbontású MT200 fluoreszcens konfokális mikroszkóppal (PicoQuant, Berlin, Németország) végeztük, időkorrelált egyfotonszámláló (TCSPC) készülékkel.A lézerdiódafejet impulzusos interleaved gerjesztésre (PIE) használják, a sugár egymódusú hullámvezetőn halad át, és 10-100 nW lézerteljesítményre van hangolva 481 nm-es és 637 nm-es lézervonalakhoz, dikroikus tükör után mérve.Ez biztosítja az optimális fotonszámlálási sebességet, elkerülve a foton-aliasing, a fényfehérítés és a telítettség hatásait.A μ-Slide angiogenezis fedőlemezeket vagy lemezeket (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Németország) közvetlenül merített vízbe helyeztük egy Super Apochromat 60x NA 1.2 lencsén, korrekciós gallérral (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Egy 488/640 nm-es dikroikus tükröt (Semrock, Lake Forest, IL, USA) használtunk fősugárosztóként.A fókuszálatlan sugárzást egy 50 mikron átmérőjű furat blokkolja, majd a fókuszált sugárzást egy 50/50-es sugárosztó 2 érzékelési útvonalra osztja.Sáváteresztő emissziós szűrőket (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 a zöld festékhez (AF488) és 690/70 a vörös festékhez (Atto647N) használtunk a detektor előtt.Detektorként egyfotonos lavinadiódákat (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Olaszország) használtak.Mind az adatgyűjtés, mind az elemzés a kereskedelemben kapható SymphoTime64 szoftverrel (PicoQuant GmbH, Berlin, Németország) történt.
Ötven mikroliter LLPS mintát vittünk fel μ-Slide angiogenezis kutakba (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Németország).Az eredményül kapott képeket 20 µm-re a kút alja fölé fókuszáljuk a lebegő cseppek optimális objektív munkatávolsága érdekében, és ~1 µm-re a tutajok és pontok esetében, legalább 0,25 µm/pixel tengelyirányú felbontással és 400 µs/pixel késleltetési idővel.Válassza ki az adatokat az átlagos háttérjel-intenzitáson (PBG, átlag + 2σ) alapuló intenzitásküszöb alkalmazásával minden csatornára úgy, hogy csak a folyékony fehérjecseppek, tutajok vagy foltok kerüljenek kiválasztásra, kiszűrve minden lehetséges eredetet a szétszórt fázisból.Az egyes csatornák (zöld, „g” az AF488 és piros, „r” az Atto647N esetében) az egyes fajok (τ) élettartamának elemzéséhez kiválasztottunk olyan érdekes régiókat (ROI), amelyek cseppeket, tutajokat vagy foltokat tartalmaznak (kiegészítő 1. ábra). ).8b), és származtatták őket az élettartamuk lecsengését (τD, τR és τP cseppekre, tutajokra vagy foltokra, lásd a 8c. kiegészítő ábrát) mindegyik csatornába farokillesztési elemzés és kétkomponensű bomlási modell segítségével.τ átlaga τ-ból.Azokat a ROI-kat, amelyek túl kevés fotont termeltek a több exponenciális illeszkedéshez, kizárták az elemzésből.A küszöbérték <104 foton volt a tutajok és pontok esetében, és 103 a cseppeknél.A cseppek küszöbértéke alacsonyabb, mert nehéz nagyobb intenzitású bomlási görbéket készíteni, mivel a képmezőben a cseppek általában kisebbek és kevesebben vannak.Azokat a ROI-kat, amelyek fotonszáma meghaladja a foton-akkumulációs határt (>500 counts/pixel), szintén elvetettük elemzés céljából.Hasonlítsa össze a vizsgált tartományból kapott intenzitás-csökkenési görbét a maximális 90%-os intenzitással (valamivel a csillapítás maximális intenzitása után) az élettartam kezdetétől, hogy biztosítsa a minimális IRF-interferenciát, miközben ugyanaz marad az összes intenzitású csillapításnál. beállítások Relatív időablak A tutajok és foltok esetében 25-50 ROI-t, a cseppek esetében pedig 15-25 ROI-t elemeztek, a képeket legalább 3 független kísérletből rögzített több mint 4 ismétlésből választották ki.Kétirányú t-próbát alkalmaztak a fajok vagy a koacervátum rendszerek közötti statisztikai különbségek értékelésére.Az élettartam (τ) pixelenkénti elemzéséhez minden csatornára kiszámítottuk az élettartam teljes csillapítását a mezőben, és egy 2/3-komponensű exponenciális csillapítási modell közelítését végeztük.Az egyes pixelekhez tartozó élettartam-csillapítást ezután a korábban kiszámított τ-értékekkel illesztettük, ami egy pszeudocolor FLIM illeszkedő képet eredményezett.A farokhoz illeszkedő élettartam-tartomány ugyanaz volt az azonos csatornán lévő összes képen, és minden egyes bomlás elegendő fotont termelt a megbízható illeszkedéshez.A FRET analízishez a pixeleket alacsonyabb, 100 foton intenzitási küszöb alkalmazásával választottuk ki, amely 11 foton háttérjelet (FBG) átlagolt.Az egyes csatornák fluoreszcencia intenzitását kísérletileg meghatározott korrekciós faktorokkal korrigáltuk: 69 spektrális áthallás α 0,004, direkt gerjesztés β 0,0305, detektálási hatékonyság γ 0,517.A FRET hatékonyságát pixel szinten ezután a következő egyenlettel számítjuk ki:
ahol FDD a donor (zöld) csatornában megfigyelt fluoreszcencia intenzitás, FDA az akceptor (piros) csatornában megfigyelt fluoreszcencia intenzitás közvetett gerjesztés mellett, FAA pedig az akceptor (piros) csatornában megfigyelt fluoreszcencia intenzitás közvetlen gerjesztés hatására ( PITE).Fluoreszcencia intenzitás impulzusok figyelhetők meg a csatornában).
Helyezzen 100 µl LLPS reakcióoldatot, amely 25 µM jelöletlen monomer Tau441-et (25 µM αS-vel vagy anélkül) tartalmaz LLPS pufferben (a fentiek szerint kiegészítve) ragasztófólia bevonattal ellátott, nem kötődő 96 lyukú mikrolemezekre, és a cseppképződést WF mikromásolással ellenőriztük. kiegyensúlyozás.10 percen belül.48 órás szobahőmérsékleten végzett inkubálás után fehérjetutajok és foltok jelenlétét igazoltuk.Ezután óvatosan távolítsa el a folyadékot a tutajok felett a lyukakból, majd adjon hozzá 50 l disszociációs puffert (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT), és inkubálja 10 percig.A magas sókoncentráció biztosítja, hogy az LLPS ne ismétlődjön meg a maradék PEG miatt, és az esetlegesen csak elektrosztatikus kölcsönhatások következtében létrejövő fehérjeegységek szétszedjenek.Az üreg alját ezután óvatosan lekapartuk egy mikropipetta hegyével, és a kapott oldatot egy üres megfigyelő lyukba vittük át.A minták 50 μM ThT-vel 1 órás inkubálása után az izolált foltok jelenlétét WF mikroszkóppal ellenőriztük.Készítsen elő ultrahanggal kezelt αS-szálakat úgy, hogy 300 µl 70 µM αS-oldatot PBS-ben (pH 7,4, nátrium-azid 0,01% 37 °C-on és 200 fordulat/perc fordulatszámmal) orbitális rázógépen 7 napig inkubál.Az oldatot ezután 9600xg-vel 30 percig centrifugáltuk, a pelletet PBS-ben (pH 7,4) újraszuszpendáltuk, és ultrahanggal kezeltük (1 perc, 50%-os ciklus, 80%-os amplitúdó Vibra-Cell VC130 szonikátorban, Sonics, Newton, USA). a kis rostok viszonylag egyenletes méreteloszlásával.
Az FCS/FCCS analízist és a kétszín-koincidencia-detektálást (TCCD) ugyanazzal az MT200 időfelbontású fluoreszcens konfokális mikroszkóppal (Pico-Quant, Berlin, Németország) végeztük, amelyet a FLIM-FRET mikroszkópos kísérletekhez használtak PIE móddal.Ezekhez a kísérletekhez a lézerteljesítményt 6,0 µW (481 nm) és 6,2 µW (637 nm) értékre adtuk.Ezeknek a lézerteljesítményeknek a kombinációját úgy választották ki, hogy hasonló fényerőt hozzanak létre a használt fluoroforpárok számára, miközben optimális számlálási sebességet érünk el, és elkerüljük a fényfehérítést és a telítettséget.Mind az adatgyűjtés, mind az elemzés a kereskedelemben kapható SymphoTime64 2.3-as verziójú szoftverrel (PicoQuant, Berlin, Németország) történt.
Az LLPS-sel nyert izolált αS/Tau aggregátumok mintáit izoláló pufferben a megfelelő monomolekuláris koncentrációra hígítjuk (tipikusan 1:500 hígítás, mivel az aggregátumok már alacsony koncentrációban vannak, amikor koacervátummintákból izolálják).A mintákat közvetlenül 1 mg/ml koncentrációjú BSA-oldattal előzetesen bevont fedőlemezekre (Corning, USA) vittük fel.
A PIE-smFRET analízishez a zöld és a piros csatornákban alacsonyabb, 25 foton intenzitási küszöböt alkalmaztunk a monomer események által okozott alacsony intenzitású jelek kiszűrésére (megjegyezzük, hogy a monomerek száma meghaladja az aggregált mintákat az izolált aggregátumokhoz képest).Ezt a küszöböt a tiszta monomer minták elemzéséből kapott monomer αS átlagos intenzitásának ötszöröseként számítottuk ki, hogy specifikusan kiválasszuk az aggregátumokat az elemzéshez.A PIE meghajtó áramkör a TSCPC adatgyűjtéssel együtt lehetővé tette egy élettartam-súlyozó szűrő alkalmazását, amely segít kiküszöbölni a háttér- és spektrális áthallást.A fenti küszöbértékekkel kiválasztott fellángolási intenzitást a csak puffert tartalmazó minták előfordulási és intenzitási hisztogramjaiból meghatározott átlagos háttérjel segítségével korrigáltuk.A nagy aggregátumokhoz kapcsolódó sorozatfelvételek általában több egymást követő tárolót foglalnak el az időnyomban (1 ms-ra beállítva).Ezekben az esetekben a maximális szilárdságú tartályt választották.A FRET és a sztöchiometrikus analízishez az elméletileg meghatározott γ gamma faktort (0,517) használtuk.A spektrális áthallás és a közvetlen gerjesztési hozzájárulás elhanyagolható (kísérletileg meghatározva) az alkalmazott gerjesztő lézerteljesítmény mellett.A FRET hatékonyságát és sztöchiometriáját robbanáskor a következőképpen számítjuk ki.