347 rozsdamentes acél tekercses cső kémiai komponense ,Új interferonra reagáló humán leukocita antigén-A (HLA-A) chaperon fehérjék azonosítása keresztkötéses tömegspektrometriával (CLMS)

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Olyan böngészőverziót használ, amely korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Ezenkívül a folyamatos támogatás érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Diánként három cikket mutató csúszkák.Használja a vissza és a következő gombokat a diák közötti mozgáshoz, vagy a végén lévő diavezérlő gombokat az egyes diák közötti mozgáshoz.

termékleírás

Rozsdamentes acél 347L tekercscsövek, acélminőség: SS347L

Az interferon jelátviteli rendszer erős citokinválaszt indukál a környezetből érkező patogén és belső patológiás jelek széles skálájára, ami interferonnal indukálható fehérjék alcsoportjainak indukcióját eredményezi.DSS-mediált keresztkötési tömegspektrometriát (CLMS) alkalmaztunk az új fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatására az interferon által indukált fehérjék doménjében.A várt interferonnal indukálható fehérjéken kívül kanonikus interferonnal indukálható fehérjék, például MX1, USP18, OAS3 és STAT1 új intermolekuláris és intramolekuláris térhálós adduktjait is azonosítottuk.A HLA-A fehérjék (H2BFS-HLA-A-HMGA1) által alkotott új interferon-indukálható fehérjehálózatok ortogonális validálására fókuszáltunk koimmunprecipitáció segítségével, valamint további vizsgálatukra molekuláris dinamikai modellezéssel.A fehérjekomplex konformációs dinamikájának modellezése számos interakciós helyet tárt fel, amelyek tükrözik a CLMS eredményekben azonosított kölcsönhatásokat.Együtt bemutatjuk a CLMS kísérleti tanulmányát az interferon által indukált új jelátviteli komplexek azonosítására, és várjuk a CLMS szélesebb körű alkalmazását a tumor mikrokörnyezetében a fehérjekölcsönhatások új dinamikájának azonosítására.
Az adaptív immunválasz megkezdése előtt a gazdaszervezet veleszületett védekező rendszere antimikrobiális választ hoz létre, amelyet a szekretált alfa-helikális citokinek családja, az interferonok (IFN-ek) közvetít.Az I. típusú IFN-osztályok, az IFNα és az IFNβ aktiválják a sejtválaszokat, beleértve az antivirális, proapoptotikus, proinflammatorikus és antiproliferatív állapotokat.Emberben az IFNa 13 altípusa ismert, mindegyik a 91. kromoszómán csoportosul. Meglepő módon csak az IFNa2-t tanulmányozták klinikai felhasználásra.Az utóbbi időben különös figyelmet fordítottak az IFNα más altípusainak kutatására.Egy közelmúltban végzett tanulmány kimutatta, hogy az IFNα14 az egyik leghatékonyabb izoforma a HBV2 és a HIV-13,4 replikáció korlátozásában a kanonikus IFNα2 altípushoz képest.
Megállapítást nyert, hogy az aktivált I. típusú interferon receptor komplexek (IFNAR1 és IFNAR2) a TYK2 és JAK15,6 Janus kinázok által közvetített jelátviteli kaszkádot váltanak ki.Ezek a Janus kinázok jelátalakítókat és transzkripciós fehérje aktivátorokat (STAT1 és STAT2) foszforilálnak a tirozin maradékokon, hogy elindítsák az SH2 domén által közvetített heterodimerizációt6.Ezt követően az IRF9 megköti a STAT heterodimereket, és az IFN-stimulált 3-as faktor gén (ISGF3) trimer komplexét képezi, amely a sejtmagba transzlokálódik, és több mint 2000 interferon-stimulált gén (ISG) transzkripcióját indukálja5,6,7,8.
Az ISG-k alkotják a veleszületett immunrendszer gerincét, különösen a vírustámadásokra adott válaszként.A vírusfertőzés elleni védekezés első vonalaként a sejtek gyorsan beépítik a sejtfehérjék kiterjedt kölcsönhatását, széles körű biológiai aktivitással.Ezek a fehérjék közé tartoznak a mintázatfelismerő receptorok, jelzőmolekulák, transzkripciós faktorok és közvetlen vírusellenes funkciókkal rendelkező fehérjék, valamint az immunválasz negatív szabályozói9.Az ISG-aktivitással kapcsolatos információk nagy része funkcionális szűrésekből származik, amelyekben túlexpressziós szűréseket10,11 vagy géncsendesítési technikákat (siRNS, RNAi és CRISPR)12,13 alkalmaznak, amelyekben az egyes ISG-ket expresszálják vagy gátolják, és aktivitásukat különböző vírusokon tesztelik.Bár ezek a vizsgálatok meghatározták az egyes ISG-k vírusellenes tulajdonságait, az egyes ISG-k mögöttes molekuláris mechanizmusok nagyrészt ismeretlenek maradnak.Általánosan elfogadott, hogy sok fehérje kölcsönhatásba lép egy vagy több citokinnel a teljes aktivitás biztosítása érdekében, így vagy az ISG-k közvetlenül kölcsönhatásba lépnek, vagy kölcsönhatásaikat sejtfehérjék közvetítik.Például egy közelmúltban végzett fotocrosslinked proteomikai tanulmány az ATPáz VCP/p97-et azonosította az IFITM3 fő interakciós partnereként, amelynek gátlása az IFITM3 lizoszómális válogatásának, forgalmának és vírusrészecskékkel való együtttranszportjának hibáihoz vezet 14 .Immunprecipitáció segítségével azonosítottuk a VAPA-t, egy vezikula-asszociált fehérjét, mint interakciós partnert az IFITM1/2/3-mal, amely a koleszterin által közvetített vírusérést közvetíti, és ezt egy másik, élesztő kéthibrid rendszert alkalmazó vizsgálat is megerősítette.Tudományos támogatás 15, 16.
A fertőzések és a rosszindulatú átalakulások visszaszorításában szerepet játszó alapvető biológiai folyamat az antigénprezentáció, amelyet a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) molekulák közvetítenek.A hasított, idő előtt terminált vagy hibásan feltekeredett fehérjékből származó peptidek (8-12 aminosav hosszúak) az MHC-I heterodimerbe (amely MHC-I nehéz és könnyű láncokból áll, úgynevezett β-2-mikroglobulin; β2M) 17,18.A kapott stabil MHC-I trimerek a sejtfelszínre kerülnek, ahol intracelluláris peptideket mutatnak be a CD8+ T-sejteknek (citotoxikus T-sejtek)17.A T-sejtek felismerik és elpusztítják ezeket a kórokozókat és a tumorspecifikus antigént hordozó sejteket.Következésképpen a kórokozók és a tumorsejtek gyakran elnyomják az antigénprezentációs folyamatot, hogy elkerüljék az immunfelügyeletet.Ezenkívül az MHC-I a humán daganatok 40-90%-ában csökken, és gyakran rosszabb prognózissal jár19.
A kórokozókra adott válaszban részt vevő géneknek gyorsan át kell váltaniuk a nyugalmi állapot és az aktív transzkripció állapota között.Ezért feltételezhető, hogy számos sejtfehérje részt vesz a nagy IFN-igényre adott válaszban rövid időn keresztül, beleértve a promoter kromatin 20,21 átalakítását és módosítását.A legtöbb tanulmány az egyes ISG fehérje partnerek azonosítására összpontosított IFN jelenlétében.Számos proteomikai és transzkriptomikai tanulmány modellsejtrendszerekben feltárta az IFN sejttájra gyakorolt ​​hatását.Annak ellenére azonban, hogy egyre jobban megértjük az interferonok által kiváltott dinamikát, még mindig keveset tudunk az ISG-k szerepéről.Az interferon jelátvitel összetettségének és időfüggő dinamikájának mérlegelésekor két kérdés merül fel: (i) lehetséges-e a gyors jelátvitelben részt vevő multiprotein komplexek stabilizálása és befogása, és (ii) ezek a kölcsönhatások leképezhetők-e a 3D térben?
E problémák megoldása érdekében diszzukcinimid szuberát által közvetített kémiai keresztkötést (DSS) valósítottunk meg tömegspektrometriával (CLMS) párosítva, hogy tanulmányozzuk az IFNα által kiváltott fehérje kölcsönhatási hálózatot és annak dinamikáját.A DSS in vivo kovalens kötéseket ad a fehérjék proximális maradékai és/vagy fehérjekomplexei között.A későbbi MS-elemzés specifikus térhálósodási helyeket tár fel, amelyek egy adott fehérjén belüli régiók térbeli közelségét tükrözik, ezeket belső kötéseknek vagy fehérjekomplexek alegységeinek nevezzük, amelyeket interrelációknak neveznek.Ezzel a megközelítéssel számos új fehérje-fehérje komplexet, valamint interferon-indukált multiprotein kölcsönhatási hálózatot azonosítottunk.Ezen új kölcsönhatások egy részhalmazának további tesztelésével kimutatjuk, hogy a H2BFS (H2B hiszton típusú FS; a továbbiakban H2B) és az MDN1 a HLA-A kötőpartnereiként működik.
A Flo-1 sejtek a nyelőcső adenokarcinóma egyik legismertebb in vitro modellje, mivel a nyelőcsődaganatok fő jellemzőit utánozzák22,23.Azonban nem minden daganat immunogén, és annak megállapítására, hogy a Flo-1 sejtek reagálnak-e az interferonkezelésre, a Flo-1 sejteket 10 ng/ml IFNα-val kezeltük 72 órán keresztül.A Flo-1 sejtek a pSTAT1 és az IRF1 korai indukcióját mutatták, amely a kezelés után 2 órával kezdődött, és 72 órán keresztül folytatódott, az IRF1 stacionárius szintjének időfüggő csökkenésével (1A. ábra).Az ISG-k (MX1, IFITM1, OAS1/2 és ISG15) 6 óra elteltével erősen indukálódtak, utánozva az IFNa-ra adott klasszikus közép- és késői fázisválaszokat (1A. ábra).Ezek az adatok együttesen arra utalnak, hogy ez a sejtmodell használható interferonválaszok tanulmányozására.
Különböző fehérje expressziós válaszok Flo-1 sejtekben IFNa kezelés után.(A) A fehérje expresszióját 10 ng/ml IFNa-val 2, 6, 24, 48 és 72 órán keresztül kezelt Flo-1 sejtekben immunoblottal elemeztük a jelzett ISG antitestek felhasználásával.(B) Coomassie kékkel festett SDS-PAGE gélek teljes sejtkivonatokból DSS-sel való keresztkötés után a megadott időpontokban és koncentrációkban.(C) Reprezentatív immunblot, amelyet ugyanazon mintákból származó p53(DO-1) antitesttel vizsgáltunk, hogy meghatározzuk a fehérje keresztkötés mértékét.
Az in situ fehérje kölcsönhatási tájkép megörökítéséhez DSS-t használtunk, amely egy széles körben alkalmazott térhálósító szer, magas membránpermeabilitása és viszonylag rövid reakcióideje miatt.A rövidebb reakcióidő segít megelőzni a térhálósított fehérjék nagy aggregátumainak képződését, ezáltal megőrzi a térhálósító stabilitását.Az optimális DSS-koncentráció meghatározása és a túlzott keresztkötések elkerülése érdekében a sejteket először 5, 2,5 és 1 mM DSS-nek tettük ki 5, 10, 5, illetve 30 percig, és a lizátumokat Coomassie-festett SDS-PAGE-val elemeztük. (az adatok nem láthatók) .Úgy tűnik, hogy a sejtlizátumok erősen térhálósodnak a legalacsonyabb koncentrációban és a legrövidebb időpontban.Ezért a DSS-t 1, 0,5 és 0,1 mM-ra titráltuk 5 perc alatt (1B. ábra).Az optimális térhálósodást 0,5 mM DSS-sel 5 percig figyeltük meg, és ezeket a körülményeket választottuk az IFNa-val kezelt sejtekhez.Ezen túlmenően, az 1C. ábra Western-blotot mutat be, amelyet p53 (DO-1) antitesttel végeztünk a fehérje-keresztkötés mértékének meghatározására.
A Flo-1 sejteket 10 ng/ml IFNa-val kezeltük 24 órán át, mielőtt hozzáadtuk a térhálósítót.A térhálósított sejteket ezt követően kétlépéses proteolízissel lizáltuk, és a fehérjéket FASP-vel dolgoztuk fel (2. ábra)24,25.A térhálósított triptikus peptideket tömegspektrometriával elemeztük (2. ábra).Az MS/MS-spektrumokat ezután a fehérjeszekvenciához illesztjük, és mennyiségileg meghatározzuk MaxQuant26,27-tel.A kapott spektrumokból a SIM-XL programmal térhálósított peptideket azonosítottunk, és az egyes vegyületeket az xQuest28 és SIM-XL29 nyílt forráskódú számítási szoftver pipeline-ok segítségével komplex hálózattá egyesítettük (2. ábra).A SIM-XL azonosítja a fehérje-fehérje kölcsönhatásokat, a belső láncokat és az egyedi láncokat egyszerű vagy összetett fehérjekeverékekben, és szkripteket biztosít a fehérjeszerkezetekben történő kölcsönhatások megjelenítéséhez.Ezenkívül minden kereszthivatkozást azonosító pontszámként rangsorol az MS/MS29 spektrum minőségének megfelelően.Számos rendkívül megbízható fehérje-fehérje kölcsönhatást és komplexet azonosítottak, és a kölcsönhatások egy új halmazát vizsgálták tovább koimmunprecipitáció és a komplexek konformációs változásai segítségével molekuláris dinamikai (MD) modellezés segítségével (2. ábra) 30, 31.
A CLMS módszer vázlatos áttekintése.A Flo-1 sejteket 10 ng/ml IFNa-val kezeltük 24 órán át, majd in situ fehérje keresztkötést DSS-sel, majd sejtlízist és tripszinezést követett.A térhálósított mintákat Orbitrap tömegspektrométerrel elemeztük, és további mintákat vettünk a peptid-prekurzorok fragmentálására az LC-MS/MS során.A kapott spektrumokból két kapcsolt peptidet azonosítottunk a Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL) program segítségével, és az összes vegyületet számítási csővezetékek segítségével összetett hálózattá egyesítettük.Szűrje ki az alacsony megbízhatóságú kölcsönhatásokat a hamis pozitív arány (FDR) pontszámok alapján.Számos új, nagy pontosságú fehérje-fehérje kölcsönhatást tovább erősítettek koimmunprecipitációval, és molekuláris dinamikai (MD) modellezéssel vizsgálták a komplexek konformációs változásait.
Összesen ~ 30 500 és ~ 28 500 peptidet detektáltunk a MaxQuant használatával stimulálatlan és stimulált IFNa mintákban (S1 kiegészítő táblázat, 3A. ábra).A peptidhossz-eloszlás mindkét esetben a nagyobb peptidek nagyobb arányát mutatta, ami keresztkötött peptidek jelenlétét jelzi (3B. és C. ábra).Ezenkívül a nagyobb peptidek nagyobb hányada volt jelen a 40-55 tartományban az IFNα-val kezelt mintákban (3C. ábra).A log2 intenzitás függvényében végzett fehérjetérképezés azt mutatta, hogy a klasszikus interferon-stimulált fehérjék voltak a legnagyobb mennyiségben a kezeletlen mintákhoz képest, beleértve az MX1-et, IFIT1/3-at, OAS2/3-at, DDX58-at és HLA-F-et (3D. ábra).Az IFNa-kezelés hatására több mint háromszorosára feldúsult fehérjék útvonalainak a Reactome útvonaladatbázis segítségével történő elemzése azt mutatta, hogy az MHC-I által közvetített antigénprezentáció és -feldolgozás volt a legdominánsabb útvonal (3E. ábra).A korábbi jelentésekkel összhangban az OAS és ISG15, valamint az IFNα/β és a citokin jelátvitel által közvetített vírusellenes válaszok az aktivált útvonalak közé tartoztak.Ezenkívül az eredetileg szerzett MS/MS spektrumokból SIM-XL segítségével lizin- és szerinspecifikus fehérje keresztkötéseket azonosítottunk.Egy közelmúltban készült tanulmány 104 ISG-ről számolt be, amelyek 9 vírusosztályból 20 vírust ölelnek fel az 5 sejttípuson végzett egyedi ISG-túlexpressziós vizsgálatok metaanalízise alapján9.A nagy adatkészletek szűrésének számítási korlátainak leküzdése érdekében azonban egy kisebb adatkészlettel kezdtünk, hogy feltárjuk a Padaria és munkatársai által közölt IRDS-gének listája közötti lehetséges kölcsönhatásokat, amelyek többsége ISG.
Az IFNα-ra adott válaszként eltérően expresszált keresztkötésű fehérjék azonosítása (az adatok a MaxQuanttól származnak).(A) Venn diagram, amely az IFNα14-gyel kezelt és kezeletlen Flo-1 mintákban azonosított közös és kizárólagos peptidek számát mutatja.Kezeletlen (B) és IFNα-val kezelt (C) térhálósított minták peptidhossz-eloszlása.(D) Hőtérkép, amely log2-t (LFQ intenzitás) reprezentál a kezeletlen és az IFNa14-gyel kezelt Flo-1 sejtek között.A bal oldali panel az IFNα jelenlétében legaktívabban aktivált fehérjéket mutatja.(E) hisztogram, amely a 20 fő dúsulási utat reprezentálja az IFNα-kezelés után.A Reactome útvonaladatbázis több mint négyszeres változást elemzett a felszabályozott IFNα-reszponzív fehérjékben.
Nagy biztonsággal vizsgáltuk a fehérje kölcsönhatásokat az ismert ISG-k között.Ezek az α-hélixek spirális hélix szerkezetet alkotnak, amely túlnyomórészt hidrofil felületet biztosít a kölcsönhatások létrejöttéhez 35 .
IFNα-val kezelt, térhálósított sejtekben azonosított fehérje-fehérje ISG hálózat.(A) 2D interakciós diagram, amely fehérje-fehérje kölcsönhatásokat mutat (a SIM-XL programban generált), az intermolekuláris kölcsönhatásokat ábrázoló vonalakkal (a keresztkötés határértéke 3,5).A különböző identitású tartományokat színükkel jelöljük32: MX1 domain, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) és GED (569–660).OAS3 tartományok: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) és OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) és FN3 (777–864).STAT1 mezők: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) és STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Keresztkötéses fehérjék (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 és STAT1) körkörös nézője kék és piros színnel jelölt kölcsönhatásokkal és kölcsönhatásokkal.A keresztkötési küszöböt 3,5-re állítottuk be.A pontdiagramok a STAT1 kölcsönhatási helyeket jelzik az MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) és OAS3 (F), valamint K vagy S kölcsönhatási helyeket a két peptid között.Az ábrán a keresztkötési pontszám küszöbértéke 3,0.(G) Különféle interakciós helyek a STAT1 és OAS3 DI domének között a fehérjeszerkezetükre ráhelyezve PyMol-ban (PyMOL molekuláris grafikus rendszer, 2.0 verzió, Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb azonosító: 1bf533) és OAS3 (pdb azonosító: 4s3n34).) program.
Az USP18 két izoformáját írták le emberekben, egy teljes hosszúságú fehérjét, amely túlnyomórészt a sejtmagban található, és egy N-terminális domén nélküli izoformát, az USP18-sf-et, amely egyenletesen oszlik el a citoplazmában és a sejtmagban36.Ezenkívül az N-terminálisról azt jósolták, hogy strukturálatlan, és nem igényel izopeptidáz aktivitást vagy ISG1537 kötődést.A vizsgálatunkban azonosított kölcsönhatások többsége a fehérje N-terminálisán található, ami arra utal, hogy ezek a kölcsönhatások a teljes hosszúságú USP18-at érintik (4A, D ábra), és így valószínűleg a sejtmagban fordulnak elő.Ezenkívül adataink azt is jelzik, hogy az N-terminális fehérje-fehérje kölcsönhatásokra specializálódott.Az IFNAR2 kötőhely a 312-368. aminosavak között található, és nevezetesen, a komplexben egyetlen fehérje sem kötődik ehhez a régióhoz (4A. ábra)37,38.Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy az IFNAR2-kötő domént kizárólag a receptorfehérje használja.Ezenkívül csak az OAS3 és a ROBO1 volt kapcsolatban az N-terminális és az IFNAR2 kötőhely előtti doménekkel (4A. ábra).
A ROBO1 a transzmembrán jelátviteli molekulák immunglobulin (Ig) szupercsaládjába tartozik, és öt Ig doménből és három fibronektin (Fn) doménből áll az extracelluláris régióban.Ezeket az extracelluláris doméneket egy membrán-proximális régió és egyetlen transzmembrán hélix követi 39. A C-terminálison egy strukturálatlan intracelluláris régió található, és konzervált szekvencia motívumokat tartalmaz, amelyek közvetítik az effektor fehérje kötődését39.A ~1100-tól 1600-ig terjedő aminosavak régiója többnyire rendezetlen.Azt találtuk, hogy az MX1 kölcsönhatásba lép a ROBO1-gyel Ig, Fn és intracelluláris doméneken keresztül, míg a STAT1-vel a legtöbb kölcsönhatás a CCD, a linker domén és a ROBO1 C-terminálisa között lép fel (4A, E ábra).Másrészt a DI, DIII és OAS3 linkerrégiókkal való kölcsönhatások eloszlottak a ROBO1 fehérjében (4A. ábra).
Az oligoadenilát szintáz (OAS) fehérjecsalád elfogadja és megköti az intracelluláris kettős szálú RNS-t (dsRNS), konformációs változásokon megy keresztül, és 2',5'-kapcsolt oligoadenilátokat (2-5 As) szintetizál40.Azt találták, hogy a három OAS közül az OAS3 mutat a legnagyobb affinitást a dsRNS-hez, és a legkevesebb 2-5 As-t szintetizálja, ami képes aktiválni az RNáz L-t, és ezáltal korlátozni a vírus replikációját41.Az OAS család béta polimeráz (pol-β)-szerű nukleotid transzferáz doménekből áll.Korábbi kutatások kimutatták, hogy a C-terminális domén (DIII) katalitikus aktivitása a dsRNS-kötő doméntől (DI) függ, amely az OAS342 aktiválásához szükséges.Megfigyeltük, hogy az OAS3 DI és DII doménjei kölcsönhatásba lépnek a CCD-vel és egy kis csomóponti régióval az SH2 és a STAT1 TAD között (4A, F ábra).A fehérjeszerkezeten a különböző térhálósító helyek átfedése kölcsönhatást mutatott ki a β-lap és a DBD STAT1 hurok, valamint egy nyitott zseb vagy üreg között, amelyet az OAS3 DI doménjének 60-75. maradékai alkotnak (4G. ábra).A fehérjék orientációja a komplexben azt is jelezte, hogy az OAS3-mal való kölcsönhatások egyike sem zavarta a DI doménjének DNS-kötő képességét (S1A ábra).Ezenkívül a GTPase MX1 N-terminális doménje kiterjedt kölcsönhatásba lép az OAS3 DI és DIII doménjeivel (4A. ábra).Megfigyeltük az OAS1 és az MX1 közötti kölcsönhatást mindhárom IFNα-val kezelt ismétlésben, ahol egyetlen OAS1 domén (szintén katalitikusan aktív) kölcsönhatásba lép mindhárom MX1 doménnel (S2A, B ábra).
Az MX fehérjék a dyneinszerű GTPázok nagy családjának részei, amelyek tartalmaznak egy N-terminális GTPáz domént, amely megköti és hidrolizálja a GTP-t, egy köztes domént, amely közvetíti az önszerveződést, és egy C-terminális leucin cipzárt, amely GTPázként működik (LZ). ).Domain effektor domain25,43.Az MX1 a víruspolimerázok alegységeihez kötődik, hogy blokkolja a vírusgén transzkripcióját43.Egy korábban közölt élesztő két-hibrid szűrése kimutatta, hogy a PIAS1-asszociált MX1 gátolja a STAT1 által közvetített génaktivációt azáltal, hogy blokkolja a DNS-kötő aktivitást, és SUMO E344,45 ligáz aktivitással is rendelkezik.Itt bemutatjuk, hogy az MX1 kötődik a STAT1-hez (4C, D ábra), azonban további tanulmányozást igényel, hogy ez a kölcsönhatás hogyan befolyásolja a STAT1 által közvetített génaktivációt az IFNα-ra válaszul.Ezenkívül azt is megállapítottuk, hogy az MX1 kölcsönhatásba lép az IFIT3-mal és a DDX60-nal mindhárom IFNα-val kezelt ismétlésben (S2C ábra).
A DDX60 egy IFN által indukált citoplazmatikus helikáz, amelyről korábban beszámoltak arról, hogy szerepet játszik a vírus RNS46 RIG-I-független lebontásában.Kölcsönhatásba lép a RIG-I-vel, és ligandum-specifikus módon aktiválja annak jelátvitelét 46. A DDX60 egy DEXD/H-Box helikáz doménből és egy C-terminális helikáz doménből áll, amelyek megkötik a virális RNS-t és DNS-t47.A legtöbb kölcsönhatás az MX1-gyel és az IFIT3-mal a hosszú N- és C-terminális régiókban fordul elő kanonikus domének vagy motívumok nélkül (S2E, F ábra).Az MX1 azonban a DEXD/H-Box helikáz tartományhoz is kapcsolódik (S2E ábra).Az IFIT család fehérjéinek tandem másolatai vannak egy jellegzetes hélix-turn-helix motívumból, amelyet tetrapeptid ismétlődésnek (TPR) neveznek.Az IFIT3-ról kiderült, hogy a RIG-I jelátvitel pozitív modulátora, és így a MAVS komplex komponense.Összességében adataink arra utalnak, hogy az IFIT3 és a DDX60 elsősorban az IFIT3 TPR 3-6 közötti régiójában lép kölcsönhatásba, és szerepet játszhat a RIG-I/MAVS jelzésben (S2F ábra).
Tekintettel arra, hogy a teljes proteom szűrése számításigényes, ezt követően a teljes humán UniProt adatbázist megvizsgáltuk az egyik IFNα-val kezelt ismétlődés jelenlétére.Ebben a replikában számos rendkívül megbízható interakciós hálózatot találtunk a HLA-A számára.Az MS/MS spektrumokkal azonosított fehérjeútvonalak elemzése azt mutatta, hogy az MHC-I alapú antigénfeldolgozás és -prezentáció az interferon által indukált fő útvonal (3D. ábra).Ezért az MHC-I molekulák fehérje kölcsönhatásának vizsgálatára összpontosítottunk nagy biztonsággal minden térhálósított mintában.A HLA α1, α2 és α3 doménekből és könnyű láncokból áll, a β2 mikroglobulin (β2m) pedig egy állandó chaperon fehérje49.Miután az endoplazmatikus retikulumban összeállt, a HLA instabil peptid ligandumok hiányában50.A peptidkötő barázdát az erősen polimorf és strukturálatlan α1 és α2 domének alkotják nem peptid formában, valamint a viszonylag kevésbé polimorf α351 domén.IFNα jelenlétében két HLA-A komplexet detektáltunk: az egyik a HMGA1-gyel és a H2B-vel (5. ábra, S3. táblázat), a másik pedig az MDN1-gyel, az LRCH4-gyel és a H2B-vel lép kölcsönhatásba (6. ábra).
Az IFNα HLA-A interakciós hálózatot indukál a H2B-vel (H2BFS) és a HMGA1-gyel.(A) 2D diagram (SIM-XL szoftverben generálva), amely a H2B-HLA-A-HMGA1 komplexum különböző típusú interakcióit ábrázolja: interlink (kék), interlink (piros) és egyetlen link (fekete)..A különböző identitású domainek színkóddal vannak ellátva32: H2B (hiszton; 2–102) és MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 csoport; 210–290 és MHC_I_C; 337–364).A keresztkötési küszöböt 3,5-re állítottuk be.A pontdiagramok HLA-A kölcsönhatási helyeket jeleznek H2B-vel (B) és HMGA1-gyel (C), valamint K vagy S kölcsönhatási helyeket a két peptid között.Az ábrán a keresztkötési pontszám küszöbértéke 3,0.(D) A PyMOL programban a H2B, HLA-A és HMGA1 fehérjék szerkezetében bemutatott fehérjék közötti kapcsolatok.Ezeket a struktúrákat a Phyre2 szerver (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) segítségével modelleztük, a H2B, HLA-A és HMGA1 fehérjék templátstruktúrái pedig 1kx552, 1kj349 és 2eze55 voltak.
Az IFNα HLA-A interakciós hálózatot indukál a H2B-vel (H2BFS), az MDN1-gyel és az LRCH4-gyel.(A) Intramolekuláris (piros) és intermolekuláris (kék) keresztkötések egy 2D interaktív térképen (SIM-XL szoftverben generálva), az MDN1 körben ábrázolva.A keresztkötési küszöböt 3,5-re állítottuk be.A különböző identitású domainek színkóddal vannak ellátva32: H2B (hiszton; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 csoport; 210–290 és MHC_I_C; 337–364) és LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) és CH (535–641)).(B) A PyMOL programban a H2B, HLA-A, LRCH4 és MDN1 fehérjék szerkezetében bemutatott fehérjék közötti kapcsolatok.Ezeket a struktúrákat a Phyre2 szerver (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) segítségével modellezték 1kx552, 1kj349, 6hlu62 és 6i2665 sablonszerkezettel a H2B, HLA-A, LRCH4 és MDN1 fehérjékhez, illetőleg.Pontdiagramok, amelyek a HLA-A és a H2B (C), LRCH4 (D) és MDN1 (E) K vagy S kölcsönhatási helyeit mutatják.A telkek esetében a keresztkötési pontszám küszöbértéke 3,0 volt.
A genom integritásának megőrzése mellett a H2B hiszton részt vesz a transzkripció szabályozásában is.A H2B fehérje egy központi hisztondoménből (HFD) áll, amelyet három hurkokkal elválasztott α-hélix és egy C-terminális farok alkot 41,52.A H2B-vel való kölcsönhatás legnagyobb része az α1 hélixben történik, amely trimerizációt biztosít a HFD heterodimerrel (5A, B ábra).Bár a lizinek részt vesznek a DNS-kötésben, egyes lizinek alternatív acetilezési vagy metilációs helyek is.Például a H2B-ből származó K43, K46 és K57 aminosavak nem vesznek részt a közvetlen DNS-kötésben, hanem különféle poszt-transzkripciós módosítások célpontjai53.Hasonlóképpen, a H2B-ben lévő K44, K47 és K57 aminosavak alternatív szerepet játszhatnak IFNa jelenlétében, beleértve a más fehérjékkel való kölcsönhatásokat (5A, B ábra).Ezenkívül a H2B extrakromoszómális hiszton aktiválja az immunválaszt különböző sejttípusokban, citoszolikus szenzorként működik a fertőző ágensekből vagy sérült sejtekből származó kettős szálú DNS (dsDNS) fragmensek kimutatására54.DNS vírusok jelenlétében a H2B depléció gátolta az IFN-β termelődését és a STAT154 foszforilációját.A H2B arról is ismert, hogy gyorsabban mozog a sejtmagba és onnan, mint más maghisztonok54.A kiválasztott kezeletlen mintákban H2B kölcsönhatásokat figyeltek meg az MDN1-gyel és az LRCH4-gyel.Azt találtuk, hogy a HLA-A kölcsönhatásba lép a H2B-vel mindhárom IFNα-val kezelt mintában és egy kezeletlen ismétlődő mintában.Ezek az adatok a H2B szerepét tükrözik egy alternatív, a transzkripciós szabályozástól független fiziológiai funkcióban.
A HMGA1-et (nagy mobilitású AT-Hook 1 csoport), egy betegséget elősegítő aminosavakban gazdag kis nukleoproteint azonosítottak a HLA-A-val kapcsolatban.Savas C-terminális farokkal és három különálló DBD-vel rendelkezik, amelyeket AT horgoknak neveznek, mivel ezek a dsDNS55,56 AT-ban gazdag régiójának kisebb barázdájához kötődnek.Ez a kötődés a DNS meggörbülését vagy kiegyenesedését okozza, lehetővé téve a kanonikus transzkripciós faktorok hozzáférését a konszenzusszekvenciához.Úgy gondolják, hogy a C-terminális farok részt vesz a fehérje-fehérje kölcsönhatásokban és a transzkripciós faktorok toborzásában, mivel a C-terminális deléciós mutánsok nem képesek transzkripciót elindítani57.Ezenkívül ez a domén számos konzervált foszforilációs helyet tartalmaz, amelyek a kinázok ismert szubsztrátjai58.HLA-A és H2B kölcsönhatásokat figyeltünk meg a HMGA1-gyel a C-terminális doménen kívül, ami arra utal, hogy a C-terminális domént főként transzkripciós faktor kötésére használják (5A, C ábra).A HMGA fehérjék versengenek a H1 hisztonnal az adapter DNS-hez való kötődésért, ezáltal növelve a hozzáférhetőséget57.Hasonlóképpen valószínűnek tűnik, hogy a HMGA kölcsönhatásba lép a H2B hisztonnal a linker DNS mentén, versengve a H1 hisztonnal.A HMGB1 indukálja a HLA-A, -B és -C expresszióját dendritikus sejtekben, ami aktiválódásukhoz vezet59, de a HMG és a HLA közötti kölcsönhatásról korábban nem számoltak be.Azt találtuk, hogy a HMGA1 kölcsönhatásba lép a HLA-A α1 és α3 doménjeivel, és a legtöbb kölcsönhatás a 3 DBD-n kívül esik (5A, C ábra).A mi kezünkben a HLA-A a sejtmagban lokalizálódik (az adatokat nem mutatjuk be), és mivel a H2B és a HMGA1 is jelen van a sejtmagban, ez a kölcsönhatás valószínűleg a sejtmagban történik.A H2B, HLA-A és HMGA1 között mért specifikus adduktumokat az 5D. ábra mutatja.
A HLA-A legtöbb kölcsönhatása más fehérjékkel az α1 és α2 doménjein és a rendezetlen C-terminális doménjén belül történik (6. ábra).Az egyik ilyen példában azt találtuk, hogy a HLA-A kölcsönhatásba lép az LRCH4 rendezetlen N-terminális farkával (6A, D ábra).Az LRCH4 szabályozza a TLR4 aktiválását és az LPS citokin indukcióját, ezáltal modulálja a veleszületett immunválaszt60,61.Ez egy membránfehérje kilenc leucinban gazdag ismétlődéssel (LRR) és egy kalmodulin (CH) homológia motívummal az ektodoménjében, amelyet egy transzmembrán domén (TMD) követ60, 62.A CH doménekről beszámoltak arról, hogy fehérje-fehérje kölcsönhatásokat közvetítenek60.Az LRR és CH domének közötti körülbelül 300 aminosavból álló szakasz viszonylag hozzáférhető, de rendezetlen.A rendezetlen régiók fehérje-fehérje hálózatok és vezikuláris transzport közvetítői funkciója alapján 63 azt találtuk, hogy a legtöbb fehérje kölcsönhatás a rendezetlen régiókban fordul elő.Az MDN1-gyel való kölcsönhatások a fehérje teljes hosszában eloszlottak, beleértve az LRR1, LRR6, CH doméneket és véletlenszerű régiókat, míg a H2B főként a CH doménhez kötődött (6A, B ábra).Figyelemre méltó, hogy egyik interakció sem tartalmazta a TMJ-t, ami a CLMS megközelítés specifikusságára utal (6A, B ábra).
Az MDN1-et a HLA-A fehérjehálózat részeként is azonosították (6A. ábra).Az AAA fehérjék családjába tartozik (különböző aktivitásokhoz kapcsolódó ATPázok).Ez ugyanaz az N-terminális AAA domén, amely hexamer gyűrűvé szerveződik, és eltávolítja az összeállítási faktort a 60S 64 riboszomális alegységből.Úgy tűnik, hogy hasonló a dynein64,65,66 -hoz.Ezenkívül az Asp/Glu-ban gazdag régiót a MIDAS domén (fémion-függő hely) követi.Az MDN1 nagy mérete (körülbelül 5600 aminosav) és a jól tanulmányozott fehérjékkel való korlátozott homológiája miatt keveset tudunk szerkezetéről és emberi működéséről.Azonosítottuk a HLA-A-t, H2B-t és LRCH4-et MDN1-kötő partnerként, és felfedtük a PyMol fehérjekomplexének orientációját (6A, B ábra).Ez a három fehérje kölcsönhatásba lép az AAA doménnel, a dynein-szerű linker doménnel és esetleg a MIDAS MDN1 doménnel.Egy korábbi jelentésben a csalifehérjék affinitási tisztítása az MDN1-et a H2B67 hisztonhoz kapcsolódó fehérjeként azonosította.Ezen túlmenően, egy közelmúltban végzett tanulmány az MDN és a HLA-B közötti kölcsönhatásról is beszámolt HCT116 sejtekben affinitástisztított tömegspektrometriával, ami alátámasztja megállapításainkat68.Ennek a komplexnek az IFNα-val kezelt mintákban történő azonosítása arra utal, hogy az MDN1 szerepet játszik az interferon jelátvitelben.
Mivel a HLA gének erősen polimorfak, a Flo-1 sejtek RNS szekvenálási adataiból kivontuk a HLA-A, -B és -C szekvenálási leolvasásokat (az adatokat nem mutatjuk be).A szekvenálási leolvasással összhangban lévő peptidszekvenciák szignifikáns különbségeket tártak fel a HLA-A, -B és -C között azokban a régiókban, ahol a HLA-A-ban keresztkötött peptidek találhatók (S3. ábra).Ezenkívül nem figyeltünk meg a HLA-B/C molekulák és a H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 fehérjék fehérje-fehérje keresztkötését.Ez arra utal, hogy a HLA-A, MDN1, LRCH1 és HMGA1 között talált fehérjekölcsönhatás HLA-A-specifikus.Ezenkívül a nem térhálósított minták proteomikai elemzése (S4 táblázat) azt mutatta, hogy a HLA-A magasabb szekvencialefedettséggel rendelkezik, mint a HLA-B vagy a HLA-C.A HLA-A-ra azonosított peptidek nagy intenzitásúak voltak mind az IFNα-val kezelt, mind a kezeletlen mintákban.
Annak biztosítására, hogy az itt azonosított kölcsönhatások ne két fehérje nem specifikus keresztkötéséből adódnak szoros térbeli közelségben, további két új HLA-A kölcsönhatásba lépő faktort is megerősítettünk koimmunprecipitációs vizsgálatokkal.Az endogén MDN1 és H2B közötti HLA-A kölcsönhatásokat mind az IFNα-val kezelt, mind a kezeletlen Flo-1 sejtekben kimutatták (7. ábra, S4. ábra).Megerősítettük, hogy a HLA-A-t befogta a H2B az immunprecipitátumokban, és ez az összefüggés az IFNa-kezelésnek köszönhető, mivel a HLA-A hiányzik a kezeletlen sejtekből származó immunprecipitátum mintákban (7A. ábra).Adataink azonban arra utalnak, hogy az IFNα eltérően szabályozza a HLA-A kötődését a H2B-hez és az MDN1-hez.Az IFNα asszociációt vált ki a H2B és a HLA-A között, de csökkenti az MDN1-gyel való kapcsolatát.Azt találtuk, hogy az MDN1 a HLA-A-val társult a kontrollokban, és az IFNα hozzáadása csökkentette ezt a kölcsönhatást, függetlenül az IFNα által kiváltott MDN1-indukciótól (7B, C ábra).Ezenkívül a HLA-A immunprecipitáció befogta a H2B-t A549 sejtekben (S4 ábra), ami arra utal, hogy ez a kölcsönhatás független a sejttípustól.Összességében ezek az eredmények alátámasztják a HLA-A interferon által közvetített kölcsönhatásait H2B-vel és MDN1-gyel.
A HLA-A együtt tisztázza a H2B-t és az MDN1-et.Reprezentatív endogén H2B (A) és MDN1 (B) immunoblotokat immunprecipitáltunk IFNa-val kezelt Flo-1 sejtekből, és megvizsgáltuk a jelzett antitesteket.Negatív kontrollként egér és nyúl IgG-t használtunk.(C) A különböző antigének relatív mennyiségét (bemenetét) a jelzett antitestek ellen szondázott immunblotokkal ábrázoltuk, terhelési kontrollként β-aktint használtunk.
Vizsgálták az egyik interferon-indukált nagy megbízhatóságú keresztkötéses hálózat, a H2B-HLA-A-HMGA1 szerkezeti tulajdonságait.Alternatív megközelítésként a molekuláris dinamikai modellezést alkalmaztuk a komplexben részt vevő fehérjék konformációs dinamikájának megértésére (8. ábra).A CLMS adatokból származó következtetések a H2B, HLA-A és HMGA1 fehérjék eltérő konformációinak lehetőségére utalnak.Ezért a következő potenciális komplexeket modelleztük oldószeres közegben: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A és H2B-HLA-A-HMGA1.A MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) csomagot használó kezdeti fehérje-fehérje dokkoló szűrés olyan lehetséges konformációkat javasolt, amelyek különböznek e fehérjék között (8A. ábra).A dokkoló fehérjekomplex megjelenítése számos kölcsönhatást és lehetséges konformációt tárt fel (5A, 8. ábra).Így egy lehetséges konformációt mutatunk be a 8A. ábrán (jelölt keresztkötésekkel), amelyet tovább értékeltünk az MD modellező folyamat segítségével.Ezenkívül a H2B vagy HMGA1 kötődése HLA-A-hoz kiemeli a H2B magasabb affinitását HLA-A-val szemben (8A. ábra).
A H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A és H2B-HLA-A-HMGA1 komplexek közötti lehetséges hálózatok konformációs dinamikája.(A) A bal oldali panel egy 2D-s térkép (a SIM-XL szoftverben generált) intramolekuláris (piros) és intermolekuláris (kék) keresztkötésekről (a keresztkötés határértéke 3,5).Ezenkívül az azonosított térhálósító aminosavakat a H2B, HLA-A és HMGA1 fehérjék szerkezetén jelölték.Ezeknek a fehérjéknek a kapcsolódó konformációit a MOE csomagban megvalósított dokkoló csővezeték segítségével extraháltuk.A bal alsó panel a H2B-HLA-A és HMGA1-HLA-A komplexek különböző lehetséges konformációit mutatja, eltérő fehérje-fehérje kötési affinitással (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Az egyes fehérjeszerkezetek atomi pozícióinak (a hidrogénatomok kivételével) standard deviációja (RMSD).(C) Intermolekuláris fehérje-fehérje hidrogénkötés kölcsönhatások különböző szimulált komplexekből, figyelembe véve a ≥ 10 ns időtartamú specifikus kölcsönhatásokat.A h-kötés donor-akceptor vágási távolságát 3,5 Å-re, a donor-H-akceptor vágási szögét ≥ 160°-180°-ra állítottuk be.(D) Jelzett maradékok, amelyek HLA-A fehérje-fehérje kölcsönhatásokat hoznak létre megfelelő partnereikkel, ≥ 20 ns-on át, ál HLA-A-H2B és HLA-A-HMGA1 komplexekből extrahálva.A fehérjeszerkezetek átlagosan 100 ns MDS szerkezetet képviselnek.(E) A HLA-A-H2B és HLA-A-HMGA1 komplexek közötti kölcsönhatások összehasonlítva a H2B-HLA szimulációval 100 ns-on keresztül követett kölcsönhatásokkal a két peptid közötti K vagy S kölcsönhatási hely alapján.Komplexek /HMGA1-HLA-A /H2B-HLA-A-HMGA1.A keresztkötések értékelésének küszöbértékét 3,0-ra állítottuk, és figyelembe vettük a ≥ 10 ns-nál hosszabb MDS-ből származó specifikus kölcsönhatásokat.A fehérjeszerkezeteket a BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) és a Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) csomagokkal vizualizáltuk.
A HLA-A molekulák időbeli stabilitása (standard deviáció; RMSD vagy standard eltérés; RMSF) azt jelezte, hogy a H2B vagy HMGA1 fehérjék jelenléte a komplexekben stabilizálta a HLA-A-t (8B. ábra, S5. ábra).A HMGA1 fehérje szorosan kötődik a HLA-A B2M helyéhez, indukálva a HLA-A aminosavak stabilitását a HLA-A-HMGA1 vagy H2B-HLA-A-HMGA1 komplexben (8B. ábra, S5. ábra).különösen a ~60-90 és ~180-210 HLA-maradékok kevésbé rugalmasak H2B jelenlétében (8B. ábra).A H2B és a HMGA1 jobban kötődött a HLA-A-hoz a H2B-HLA-A-HMGA1 komplexben, mint a HLA-A H2B-hez vagy HMGA1-hez önmagában kötődő (8C. és D. ábra; S5. táblázat).A hidrogénkötésben részt vevő maradékok (MD modellezett magas foglaltság ≥ 10 ns) egybeesnek a komplexben lévő CLMS kölcsönhatási helyekkel (K vagy S maradékok), ami arra utal, hogy a CLMS által azonosított kölcsönhatások nagyon megbízhatóak.Megbízhatóság (8E. ábra).A CLMS és MD modellezés során a körülbelül 190-210 és körülbelül 200-220 aminosav közötti HLA-A oldalláncokról azt találtuk, hogy kötődnek a H2B-hez, illetve a HMGA1-hez (8E. ábra).
A fehérje-fehérje kölcsönhatások dinamikus szerkezeti hálózatokat alkotnak, amelyek bizonyos ingerekre válaszul intracelluláris kommunikációt közvetítenek.Mivel számos proteomikai megközelítés észleli a fehérje általános egyensúlyi állapotának változásait, a fehérje-fehérje kölcsönhatás dinamikája további eszközöket igényel a kötőfelületek rögzítéséhez, és a CLMS az egyik ilyen eszköz.Az interferon jelátviteli rendszer egy citokin hálózat, amely lehetővé teszi a sejtek számára, hogy válaszoljanak a környezeti patogén és belső patológiás jelekre, és az interferonnal indukálható fehérjék részhalmazainak indukciójában csúcsosodik ki.CLMS-t alkalmaztunk annak meghatározására, hogy azonosíthatók-e új fehérje-fehérje kölcsönhatások az interferon által indukált fehérjék panelje között.Globális fehérje-keresztkötési analízist interferonra reagáló Flo-1 sejtmodellben alkalmaztunk a fehérjekomplexek rögzítésére.A triptikus peptidek extrakciója nem térhálósított és térhálós sejtekből lehetővé teszi a peptidek számlálását, az útvonal dúsítását és a peptid hossz-eloszlását meghatározott LFQ intenzitással.A kanonikus interferonnal indukálható fehérjéket pozitív belső kontrollként azonosították, míg a kanonikus interferonnal indukálható fehérjék, például az MX1, UP18, OAS3 és STAT1 új intermolekuláris és intramolekuláris térhálós adduktjait figyelték meg.Különféle szerkezeti jellemzőket és kölcsönhatásokat vizsgáltak a funkcionális területeken.
A HLA-A, MDN1 és H2B közötti kölcsönhatást immunblot-vizsgálattal mutatták ki IFNa-val kezelt és kezeletlen Flo-1 és A549 sejtekben.Eredményeink rávilágítanak arra, hogy a HLA-A IFNα-függő módon komplexál a H2B-vel.Munkánk érdekes utat jelent e két komplexum együttes lokalizációjának további feltárásához.Érdekes lenne a CLMS-megközelítést kiterjeszteni egy sejtvonal-panelre is, hogy azonosítsuk a sejttípus-független interferon által közvetített fehérjekölcsönhatásokat.A CLMS adatokból származó következtetések a H2BFS, HLA-A és HMGA1 fehérjék eltérő konformációinak lehetőségére utalnak.
A Flo-1 sejteket az ATCC-től szereztük be, és DMEM-ben (Gibco) tartottuk, kiegészítve 1% penicillin/sztreptomicinnel (Invitrogen), 10% magzati borjúszérummal (Gibco), és 37 °C-on és 5% CO2-on tároltuk.Inkubálás.A sejteket 70-80%-os összefolyásig növesztettük, mielőtt IFNa14-gyel (gyártó: Edinburgh Protein Production Facility) kezeltük volna.Az összes többi vegyszert és reagenst a Sigma Aldrich cégtől vásároltuk, hacsak másként nem jelezzük.
A Flo-1 sejteket 6 lyukú lemezeken tenyésztettük, és másnap a sejteket 10 ng/ml IFNa14-gyel kezeltük 24 órán keresztül, hogy megközelítőleg 80%-os konfluencia legyen.A sejteket háromszor mostuk PBS-sel, és frissen készített DSS-sel (Thermo Fisher Scientific) (DMSO-ban oldva) ligáltuk PBS-ben 5 percig 37 °C-on 0,5 mM végső koncentrációig.A DSS térhálósítási reakciót PBS-re cseréltük, és a maradék DSS-t 20 mM Tris (pH 8,0) PBS-ben történő hozzáadásával állítottuk le 15 percig 37 °C-on.A sejteket kaparással gyűjtöttük össze, és alacsony kötőképességű csövekben (Axygen) gyűjtöttük össze.
Minden centrifugálási lépést 14 000 xg-vel hajtottunk végre 8 °C-on.Centrifugálja a lizátumot 10 percig, és vigye át a felülúszót egy új csőbe.A megmaradt tiszta részecskéket 150 μl második lízispufferben (2 M karbamid, 2% (w/v) SDS (nátrium-dodecil-szulfát)) 30 percig vagy tovább oldottuk, amíg homogén vizes oldatot nem kaptunk.A lizátumot 20 percig centrifugáltuk, és a felülúszót összekevertük az előző lépésben kapott lizátummal.A mintákat gyorsan lefagyasztottuk folyékony nitrogénben és -80°C-on tároltuk.
Körülbelül 100 μg oldható térhálós fehérjét dolgoztunk fel módosított szűrési minta-előkészítési protokoll (FASP) alkalmazásával Wisniewski és mtsai.69 Röviden, a fehérjét 200 µl karbamid pufferrel (8 M karbamid 0,1 M Trisben, pH 8,5) térhálósítjuk, vortexeljük és felezzük.Minden centrifugálási lépést 14 000 xg-vel, 25 °C-on végeztünk.A térhálósított fehérjelizátum első felét egy Ultracel-10 membránnal (Merck) felszerelt 10 kDa-os Microcon centrifugális szűrőkészülékbe vittük át, majd a szűrőn 25 percig centrifugáltuk.Ezután adja hozzá a fehérje második felét a szűrőhöz, és ismételje meg ugyanazokat a lépéseket.A fehérje visszanyerését 100 μl 17 mM trisz(2-karboxietil)foszfin-hidroklorid (TCEP) karbamid pufferben történő hozzáadásával végeztük.A visszanyerést termomixeren 600 fordulat/perc sebességgel 30 percig 37 °C-on kevertük.Ezenkívül az oszlopot centrifugáltuk, és a redukált térhálósított fehérjét 100 μl 50 mM jód-acetamiddal karbamidpufferben alkileztük.Az alkilezési reakciót szobahőmérsékleten 20 percig, sötétben végezzük.Forgassa meg az oszlopot, mossa meg az oszlop falait háromszor 100 µl karbamid pufferrel, majd centrifugálja.Ugyanezt a műveletet háromszor végeztük el 100 μl 100 mM ammónium-hidrogén-karbonát felhasználásával.Tripszinezés előtt cserélje ki a gyűjtőcsövet egy újra.Adjon hozzá 50 mM ammónium-hidrogén-karbonátot és 1 µl tripszin pufferrel (Promega) hígított emésztőpuffert.A tripszin és a fehérje arányát körülbelül 1:33 értéken tartottuk, és az emésztési reakciókat egy éjszakán át 37 °C-on, nedves kamrában inkubáltuk.A térhálósított peptidet 25 perces centrifugálással eluáljuk a szűrőről.A peptid visszanyerését javítottuk, ha 50 μl 0,5 M NaCl-t adtunk a szűrőhöz, majd 25 percig centrifugáltuk.
C18 Micro Spin oszlopokat (Harvard Apparatus) használtunk a térhálósított triptikus peptidek sómentesítésére a Bouchal és munkatársai által 70 leírt protokoll szerint, kisebb módosításokkal.Röviden, a C18 spin oszlopokat háromszor 0,1%-os hangyasavval (FA) acetonitrilben (AcN) (Merck) és kétszer 0,1%-os FA-val aktiváltuk.Az oszlopot 0,1% FA-val hidratáltuk 15 percig.Töltsük a mintákat centrifugális oszlopokba, és mossuk háromszor 0,1%-os FA-val.A sómentesített peptideket egymást követően lépcsőzetes gradienssel eluáltuk 50%, 80% és 100% AcN-t 0,1% FA-ban alkalmazva.A mintákat SpeedVac Plus koncentrátorban (Eppendorf) szárítottuk, amíg a maradék folyadék teljesen eltűnt.Az eluált peptideket 100 μl 0,08%-os 2,5%-os AcN-os trifluor-ecetsavban oldottuk, és a koncentrációkat NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) készüléken mértük.Mintánként körülbelül 1 μg térhálósított peptidet injektáltunk az LC-MS/MS rendszerbe.
A térhálósított peptideket UltiMate 3000 RSLCnano LC rendszeren (Thermo Scientific) választottuk el, amely Orbitrap Exploris 480 tömegspektrométerhez (Thermo Scientific) volt csatlakoztatva.A térhálósított peptideket 300 µm ID-s, 5 mm hosszú, µ-os oszlop előtti C18 befogó oszlopon gyűjtöttük össze, amely C18 PepMap100 szorbenssel és 5 µm PepMap szorbenssel volt megtöltve (Thermo Scientific).Töltse be a szivattyú áramlási készletét 5 µl/perc sebességgel 0,08%-os trifluor-ecetsav 2,5%-os ecetsavban oldva.A térhálósított peptideket 75 μm belső átmérőjű és 150 mm hosszúságú, 2 μm-es PepMap szorbenssel (Thermo Scientific) töltött analitikai fuzionált szilika oszlopon választottuk el.Az A és B mozgófázis 0,1% FA-t tartalmazott vízben és 0,1% FA-t acetonitrilben.A gradiens 2,5% B-nél kezdődik, és lineárisan növekszik 40% B-ig 90 perc alatt, majd 90% B-ig a következő 2 perc alatt.A mozgófázis-összetételt 90% B-n tartottuk 10 percig, majd 2 perc alatt lineárisan 2,5% B-re csökkentettük.Az oszlopot a következő ciklus előtt 2,5% B mellett 8 percig egyensúlyoztuk.Az analitikai oszlopról eluált térhálós peptideket nanoelektrospray ionizációs (NSI) forrásban ionizáltuk, és Exploris 480 tömegspektrométerbe (Thermo Scientific) injektáltuk.
Az Orbitrap Exploris 480 tömegspektrométer pozitív adatkorrelációs módban működött.A teljes letapogatást szakasz módban 120 000-es felbontással m/z 350 Th és m/z 2000 Th közötti tartománybeállításokkal végezték el.A normalizált AGC célértéket 300%-ra állítottuk be, 50 ms maximális bemeneti idővel.A peptidekre monoizotópos csúcsok kimutatását állapították meg.A kényszer relaxációs paraméter igazra van állítva, ha túl kevés prekurzor található.A prekurzor minimális ionerősségét 5,0e3-ra állítottuk be, és a prekurzor töltési állapotait +8-ig vettük figyelembe a kísérletekben.
A főbb szkennelések közötti ciklusidőt adatkorrelációs módban 2,5 másodpercre állítottuk be.A dinamikus tömegkizárást 20 másodpercre állítottuk be a prekurzor ion első fragmentációja után.A prekurzor elszigetelő ablakot 2 -re állítottuk.A normalizált ütközési energia típusát rögzített ütközési energia móddal egy adatfüggő MS/MS pásztázás során választottuk ki.Az ütközési energia 30%-ra van állítva.Az Orbitrap felbontást 15 000-re, az AGC célt pedig 100%-ra állítottuk be.Az egyéni maximális befecskendezési idő 60 ezredmásodperc.
Mielőtt a fehérje-fehérje hálózatot keresztkötött mintákban követtük volna, feldolgoztuk a nyers fájlokat a MaxQuant csomag (1.6.12.0 verzió)26,27 segítségével, hogy azonosítsuk a mintákban nyomon követhető peptideket/fehérjéket.Ezenkívül hasonló proteomikai elemzéseket végeztünk IFNa-val kezelt és kezeletlen, nem térhálósított Flo-1 mintákon.Az MS/MS adatok keresése az UniProt emberi adatbázisban (www.uniprot.org) történt (2020. augusztus 12-én feltöltve, 75 093 bejegyzést tartalmaz) a beépített Andromeda27 kereső segítségével.A keresést az enzim specifitásának és a dezamináció (N, Q) és oxidáció (M) különféle módosulásainak feltüntetése nélkül végeztük.A prekurzor tömegtűrést 20 ppm-re, a termékionokat pedig 0,02 Da-ra állítottuk be.A kezdeti és maximális tömegeltérést 10 ppm-re állítottuk be.A peptid maximális tömegét 4600 Da-ra, a szekvencia hasonlóságát 7 és 25 aminosav közé (aa) állítottuk be.A további statisztikai elemzést a Perseus programmal (1.6.10.45-ös verzió) végeztük.A fehérjetartalmat a fehérje spektrális intenzitásának normalizálásával (LFQ intenzitás; jelöletlen kvantifikáció)27 számítottuk, és az intenzitásértékeket átszámítottuk Log2-re.A peptidintenzitásuk alapján azonosított fehérjék hierarchikus klaszterezését a pheatmap (v1.0.12) csomag segítségével építettük fel az R-ben (v 4.1.2).Az útvonal-dúsítási analízist a Reactome útvonaladatbázis segítségével végezték el az IFNα-val kezelt fehérjék esetében, amelyek több mint négyszer aktiválódtak a kezeletlen mintákhoz képest.
A fehérjekomplexek lizin (K) vagy szerin (S) specifikus kémiai keresztkötéseinek azonosítását LC-MS/MS-sel monitorozva spektroszkópiai azonosító gép (SIM-XL) segítségével végeztük a térhálósított peptidek (SIM-XL)29 segítségével.Először is, az interferon-asszociált (IFN) DNS-károsodás rezisztencia aláírás (IRDS) gének közötti lehetséges kölcsönhatásokat vizsgálták a Padariya és munkatársai által leírt IRDS fehérje adatkészlet felhasználásával.A teljes humán UniProt összes állapotának és ismétlődésének szűrése számításigényes, ezért a teljes humán UniProt adatbázis (www.uniprot.org) (letöltve 2020. augusztus 12-én, 75 093 bejegyzést tartalmaz) az IFNα-val kezelt ismétlődésekkel szemben.Az egyik szűrő a nagy bizalmi interakciókhoz.Ezeket a kapott nagy jelentőségű kölcsönhatásokat kibővítettük, és minden ismétlésben és körülmény között teszteltük.
A következő térhálósító reakcióhelyeket vettük figyelembe: KK, KS és KN-TERM, riporterionok nélkül.Mind a prekurzor, mind a fragmens ppm-ét 20-ra, az Xrea-küszöböt pedig 0,15-re állítottuk.A tripszint teljesen specifikusnak tekintették, és nagy energiájú C-csapda (HCD) fragmentációs módszert alkalmaztak.Az XCorr dinamikus DB-csökkentési küszöbértéket és a peptidek minimális számát a dinamikus DB-csökkentéshez 2,5-re, illetve 2-re állítottuk be.További paraméterek a következők: monoizotóp valószínűsége és csúcskoincidencia határértéke, minimum 4 AA maradék szálonként és maximális száltöltés, valamint 3 maximum a kihagyott hasadások.A kapott összefűzött 2D térképeket (SIM-XL) elemeztük, és az xQuest28 grafikus ábrázolást használtuk a 2D térképek összeállításához.A fehérjeszerkezeteken lévő fehérje keresztkötéseket a PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, 2.0 verzió, Schrödinger, LLC) biztosítja.
A Phyre2 modellstruktúrákat generál az ismert fehérjeszerkezetekkel való szekvencia-illesztés alapján.A H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 és MDN1 fehérjék esetében az 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 és 6i2665 templátstruktúrákat használtuk.Emellett figyelembe vették az AlphaFold71 MX1, UBP18 és ROBO1 szerkezetét is.A fehérje szerkezetét a BIOVIA Discovery Studio Visualizer csomag (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) és a Molecular Operating Environment csomag (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) segítségével vizualizáltuk.