ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex hegesztett cső vegyipari kémiai komponenshez, A SPECC1L hiánya az összeillesztett ízületek stabilitásának növekedéséhez és a koponya idegi gerincsejtek csökkenéséhez vezet.

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Olyan böngészőverziót használ, amely korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Ezenkívül a folyamatos támogatás érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex hegesztett cső a vegyiparhoz

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.vezető gyártó , aki rozsdamentes acél varrat nélküli csövek , fényes izzított csövek , varrat nélküli tekercscsövek stb . gyártására specializálódott .Az ügyfelek megkönnyítése érdekében hegesztett csöveket is gyártunk.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.a legfejlettebb gyártó és vizsgáló berendezésekkel rendelkezik .Teljes mértékben eleget tudunk tenni a követelménynek .A nagyon szigorú szabvány szerint az általunk gyártott csövek mindig megfelelő OD és WT toleranciával rendelkeznek.A tolerancia ellenőrzése szigorúan megfelel a szabványoknak.Termékeink mindig elégedettek az ügyfelekkel .A termékeinket vásárló vásárlók több profitot termeltek.
a) OD (külső átmérő): 3,18-101,6 mm
b) WT (falvastagság): 0,5-20 mm
c) Hossz: az ügyfél igényei szerint
d) Szabványok: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 stb
e) Feldolgozási módszer: ERW, EFW stb

Diánként három cikket mutató csúszkák.Használja a vissza és a következő gombokat a diák közötti mozgáshoz, vagy a végén lévő diavezérlő gombokat az egyes diák közötti mozgáshoz.
A cranialis neural crest sejtek (CNCC) leválasztják az embrionális idegredőket, és a garatívek felé vándorolnak, amelyek a legtöbb középső struktúrát alkotják.A CNCC diszfunkció fontos szerepet játszik az orofacialis hasadék etiológiájában, amely egy gyakori veleszületett rendellenesség.Heterozigóta SPECC1L mutációkat találtak atípusos és szindrómás hasadékokban szenvedő betegeknél.Itt beszámolunk a kanonikus adhezív junction (AJ) komponensek, a β-katenin és az E-cadherin fokozott festődéséről tenyésztett SPECC1L knockdown sejtekben, és az elektronmikroszkópos felvételek az AJ apikális-bazális diffúzióját mutatják.Ahhoz, hogy megértsük a SPECC1L szerepét a craniofacialis morfogenezisben, létrehoztunk egy Specc1l hiányos egérmodellt.A homozigóta mutánsok embrionálisan halálosak, és károsodott idegcsőzáródást és CNCC-laminációt mutatnak.Az AJ fehérje festődés fokozódik a mutáns idegredőkben.Ez az AJ hiba összhangban van a CNCC delamináció hibájával, amely az AJ feloldását igényli.Ezenkívül a Specc11 mutánsok csökkentették a PI3K-AKT jelátvitelt és növelték az apoptózist.In vitro a PI3K-AKT jelátvitel enyhe gátlása vad típusú sejtekben elegendő volt az AJ változások indukálásához.Fontos, hogy a SPECC1L knockdown által kiváltott AJ változások visszafordíthatók a PI3K-AKT útvonal aktiválásával.Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a SPECC1L, mint a PI3K-AKT jelátvitel és az AJ biológia új szabályozója, szükséges az idegcső zárásához és a CNCC rétegződéshez.
A cranialis neural crest sejtek (CNCC-k) a dorsalis neuroectodermában lokalizálódnak, és leválanak a fejlődő idegi redők neuroepitheliumáról az epitheliális-mezenchimális átmenetet (EMT)1, 2, 3 magában foglaló folyamat révén.Az előrevándorló epiteliális CNCC-k megzavarják az intercelluláris csomópontokat, és migráló mezenchimális CNCC-kké válnak, amelyek kitöltik az első és a második garatívet, és alkotják a koponyaporc nagy részét.Így a CNCC működését szabályozó gének gyakran megszakadnak a craniofacialis veleszületett anomáliák, például az orofacialis hasadékok etiológiájában, amelyek leggyakrabban csak az Egyesült Államokban 1/800 születést érintenek.A veleszületett deformitások egyike8.
A CNCC delaminációja egybeesik az elülső idegcső záródásával egerekben az embrionális fejlődés 8,5 és 9,5 napja között.Számos egér orofaciális hasadékkal kapcsolatos gén mutánsai is mutatnak valamilyen idegcső-hibát, ideértve az Irf69, 10, Ghrl310, Cfl111 és Pdgfrα12 géneket.A neurális csőzáródás és a CNCC rétegződés folyamatai azonban függetlennek tekinthetők, mivel a Splotch mutáns egér (Pax3) hibás idegcső záródást mutat anélkül, hogy bármilyen hatással lenne a CNCC rétegződésére vagy migrációjára 13,14.További egérmodellek, amelyek hibás a CNCC disszekciójában és az idegcső záródásában, segítenek meghatározni e két folyamat közös molekuláris alapját.
A CNCC neuroepiteliális sejtekből történő izolálásához szükség van az adhezív junctionok (AJ-k) feloldására, amelyek fehérjekomplexekből állnak, amelyek többek között E-cadherint, β-katenint, α-E-katenint és α-aktinint tartalmaznak, amelyek aktin filamentumokhoz kapcsolódnak 2 Túlexpressziós vizsgálatok Az E-cadherin az idegi redőkben a CNCC delamináció csökkenését vagy késését mutatta.Ezzel szemben az E-cadherin elnyomása korai rétegződést eredményez15,16.A CNCC rétegződés során az EMT-t közvetítő számos tényező a transzkripciós faktor (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) és az extracelluláris mátrixot (ECM) átalakító fehérjék, például a mátrix metalloproteinázok (MMP-k), azonban a CNCC-k közvetlen citoszkeletális AJ szabályozók. még nem ismert.A PI3K-AKT útvonalról ismert, hogy antagonizálja az E-cadherin szintet, főleg a rákkutatásból17.A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a PDGFα-alapú PI3K-AKT jelátvitel elvesztése egerekben koponya-arc-rendellenességekhez vezet, beleértve a szájpadhasadékot és a neurális csőhibákat12.Azonban a PI3K-AKT útvonal és az AJ stabilitás közötti kapcsolat a CNCC rétegződés során nem egyértelmű.
Korábban azonosítottuk a SPECC1L-t, mint az első mutáns gént két olyan emberben, akiknél súlyos, a szájtól a szemig terjedő hasadék, ferde hasadék (ObFC) vagy Tessier IV18 hasadékként ismert.SPECC1L mutációkat azonosítottak két többgenerációs családban autoszomális domináns Opitz G/BBB szindrómában (OMIM #145410), amelyben az érintett egyének hiperdistance és ajak-/szájpadhasadék19, valamint egy családban a Tibi-túltávolság szindrómával (OMIM #145420)20. .az Opitz G/BBB szindróma eseteinek több mint fele X-hez kötött (OMIM #300000), és a MID1 gén mutációi okozzák, amely a mikrotubulusokhoz kapcsolódó sejtváz 22-es fehérjét kódolja.Feltételezzük, hogy a SPECC1L, amely szintén a mikrotubulusokhoz és az aktin citoszkeletonhoz kapcsolódó fehérje, közvetítheti az aktin citoszkeleton átalakulásához szükséges jelátvitelt a sejtadhézió és -migráció során18.In vitro és in vivo vizsgálatok során a SPECC1L-t az AJ stabilitás új szabályozójaként írjuk le a PI3K-AKT jelátvitelen keresztül.Sejtszinten a SPECC1L hiány a pán-AKT fehérje szintjének csökkenését és az AJ apikális-bazális diszperziójának növekedését eredményezte, amit az AKT útvonal kémiai aktiválásával eliminált.In vivo a Specc11-hiányos embriók károsodott idegcsőzáródást és csökkent CNCC disszekciót mutatnak.Így a SPECC1L erősen szabályozott sejtadhézión alapuló jelátvitelben működik, amely a normál CNCC-funkcióhoz szükséges az arc morfogenezise során.
A SPECC1L sejtszintű szerepének jellemzésére a korábban leírt, SPECC1L18-ban hiányos U2OS stabil osteosarcoma sejtvonalat használtuk.Ezekben a stabil U2OS-sejtekben, amelyekben SPECC1L (kd) knockdown, mérsékelten (60-70%) csökkent a SPECC1L transzkriptumok és fehérjék szintje, valamint a migráció és az aktin citoszkeleton átrendeződésének hibái 18. Ezzel szemben a súlyos, átmeneti csökkenés Kimutatták, hogy a SPECC1L mitotikus defektusokhoz vezet 23 .A további jellemzés során azt találtuk, hogy stabil SPECC1L-kd sejtjeink morfológiája igen nagy összefolyási fokon változott (1. ábra).Az egyes kontrollsejtek és az alacsony konfluenciájú kd-sejtek hasonlónak tűntek (1A, D ábra).24 órával a fúzió után a kontrollsejtek megtartották kocka alakú alakjukat (1B., E. ábra), míg a SPECC1L-kd sejtek megnyúltak (1C., F. ábra).A sejtalakban bekövetkezett változás mértékét a kontrollsejtek és a kd-sejtek in vivo élő képalkotása rögzítette (1. film).A SPECC1L konfluens sejtekben betöltött szerepének meghatározásához először annak expresszióját vizsgáltuk.Azt találtuk, hogy a SPECC1L fehérje szintje nőtt a fúzió során (1G ábra), míg a SPECC1L transzkriptum szintje nem nőtt (1H ábra).Ezenkívül a sejtsűrűség növekedésével a SPECC1L fehérje felhalmozódott az intercelluláris határokon (2A-E ábra), a membránhoz kapcsolódó β-katenin mintázatával átfedve (2A'-E' ábra).Tekintettel a SPECC1L és az aktin citoszkeleton 18, 23 kapcsolatára, azt feltételeztük, hogy a SPECC1L kölcsönhatásba lép az aktin alapú adhéziós csomópontokkal (AJ).
(AF) A SPECC1L knockdown (DF) sejtek nagy konfluenciánál (F) megnyúlnak a kontroll U2OS sejtekhez (AC) képest.Itt látható a hat időpont közül három (T1, T3, T6), amelyeket a különböző sejtsűrűségekhez választottunk.(G) Western blot analízis, amely azt mutatja, hogy a SPECC1L fehérje magas fokú konfluenciánál stabilizálódik, összehasonlítva a kontrollsejtek alacsony fokú konfluenciájával.A SPECC1L Western blotja a várt 120 kDa-os sávot és egy nagyobb molekulatömegű sávot mutat, amely valószínűleg poszttranszlációs módosult (*).A Western blot analízist azonos körülmények között végeztük alacsony és magas összefolyás esetén.A SPECC1L-t alacsony és magas konfluenciát mutató képek ugyanabból a blotból készültek.Ugyanezt a blotot eltávolítottuk, és β-aktin antitesttel újra megvizsgáltuk.(H) A kvantitatív RT-PCR analízis nem mutatott szignifikáns változást a SPECC1L transzkriptum szintjében.A hibasávok négy független kísérletből származó SEM-eket képviselnek.
(AE) Hat időpontot (T1-T6) választottunk, amelyek a sejtsűrűség tartományát képviselik, hogy normalizáljuk a sejtalak-analízist és az U2OS sejtekben az AJ változásait SPECC1L knockdown (kd) segítségével.Ezen időpontok közül az első öt az egysejteket (T1), a kis sejtklaszterek 50-70%-os fúzióját (T2), a kd-sejtek átformálását nem igénylő fúziót (T3), a kd-sejtek átformálását (T4) és a 24 órás változásokat tartalmazta.a kd (T5) sejtek hátsó alakjában.A SPECC1L fehérje túlnyomórészt a citoplazmában diszpergálódott a T1-nél (A), de felhalmozódását a sejtközi határokon figyelték meg a következő időpontokban (B-E, nyilak).(FJ) A β-catenin hasonló felhalmozódást mutat az AJ komplexhez kapcsolódó intercelluláris határokon.(A'-E') A SPECC1L és a β-catenin átfedő festődést mutat a sejthatárokon magas sejtsűrűség mellett (nyilak).(F'-J') SPECC1L-kd sejtekben a β-katenin festődés normálisnak tűnik alacsony sejtsűrűség mellett (F'-H'), de kitágul, ha a sejt alakja megváltozik (I', J'; nyilak), jelezve, hogy AJ megváltozott.Rudak = 10 µm.
Ezután megpróbáltuk meghatározni a SPECC1L-hiány hatását az AJ-re.Számos AJ-asszociált markert használtunk, köztük az F-aktint, a miozin IIb-t, a β-catenint és az E-cadherint24,25,26,27 kanonikus komponenseket.Az aktin stresszrostok megnövekedtek a SPECC1L-kd sejtekben a korábban leírtak szerint (3A, B ábra)18.Az aktin filamentumokhoz kapcsolódó miozin IIb hasonló növekedést mutatott a SPECC1L-kd sejtekben in vitro (3C. és D. ábra).Az AJ-asszociált β-catenin a sejtmembránon kötődik a kadherinhez, normális „méhsejt” expressziós mintát mutatva a kontroll kubocitákban (3E, G ábra).Érdekes módon a konfokális mikroszkóppal készített lapos képeken a β-catenin (3E, F ábra) és E-cadherin (3G, H ábra) festődése az összefolyó SPECC1L-hiányos sejtek sejtmembránján a kiterjesztett festődés kiemelkedő mintázatát mutatta.Az AJ-asszociált β-catenin festődésnek ez a kiterjedése a kd sejtekben a konfluenciánál volt a legkifejezettebb, de úgy tűnt, hogy megelőzte a sejt alakjában bekövetkező változásokat (2F-J, F'-J' ábra).A kiterjesztett AJ festés fizikai természetének meghatározásához transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) vizsgáltuk a SPECC1L-kd U2OS sejtek apikális-bazális felszínén lévő sejthatárokat (3I., J ábra).Ellentétben a kontrollsejtekkel (3I. ábra), amelyeknek külön elektronsűrűségű régiói voltak, amelyek AJ-t jeleztek (nyilak), a kd-sejtek (3J. ábra) nagy, összefüggő, nagy elektronsűrűségű régiókat mutattak, amelyek AJ-t jeleznek az apikobazális sík mentén..Ezenkívül a keresztirányú metszeteken kiterjedt sejtmembrán redőket figyeltünk meg a kd sejtekben (S1A, B ábra), ami megmagyarázza a β-katenin és E-cadherin festődési sávok kiterjesztett mintázatát (3F, H ábra).A SPECC1L AJ-kben betöltött szerepének alátámasztására a β-katenint SPECC1L-lel együtt immunprecipitáltuk az összefolyó U2OS sejtek lizátumaiban (3K. ábra).Az AJ markerek kiterjesztett immunfestésével együtt a TEM analízis összhangban volt azzal a hipotézisünkkel, hogy a SPECC1L hiány növeli az AJ apikális-bazális sűrűségét és varianciáját.
(AH) Fokozott F-aktin festődés a kd sejtekben 48 órával a fúzió után (T6; A, B).Az F-aktinnal kapcsolatos miozin IIb megváltozott festődése (C, D).A β-catenin és E-cadherin membránfestődés sima mintázata a kontrollsejtekben (E, G) fokozódott SPECC1L-kd (F, H) sejtekben.Rudak = 10 µm.(I–J) Elektronmikroszkópos felvételek az apikális-bazális intercelluláris találkozásról.A kontrollsejtek elkülönülő elektronsűrűségű régiókat mutatnak, amelyek ragacsos csomópontokat jeleznek (I, nyilak).Ezzel szemben a SPECC1L-kd sejtekben a teljes apikális-bazális csomópont elektronsűrűnek tűnt (J, nyilak), ami a tapadó csomópontok megnövekedett sűrűségét és diszperzióját jelzi.(K) A β-katenint SPECC1L-lel együtt immunprecipitáltuk konfluens U2OS sejtlizátumokban.A kép egy helyről készült, amely a négy független kísérlet egyikét képviseli.
Ahhoz, hogy megértsük a SPECC1L szerepét a craniofacialis morfogenezisben, létrehoztunk egy Specc1l-hiányos egérmodellt két független ES csapda sejtvonal, a DTM096 és RRH048 (BayGenomics, CA) felhasználásával, amelyek az 1. intront képviselik, és a Specc1l transzkriptumokat 15-nél rögzítettük (1. ábra). .4A, S2 ábra).A csali vektor inszert genomi helyét a teljes genom szekvenálása határozta meg, és PCR-rel megerősítette (S2 ábra).Mindkét géncsapda-konstrukció lehetővé tette a Specc11-lacZ riporterek képkockán belüli fúzióját a befogáskor.Ezért az X-gal festéssel meghatározott lacZ expressziót használtuk a Specc11 expresszió indikátoraként.Mindkét allél hasonló lacZ expressziós mintázatot mutatott, a DTM096 géncsapda az 1. intronban erősebb expressziót mutatott, mint az RRH048 a 15. intronban (nincs ábrázolva).A Specc1l azonban széles körben expresszálódik, különösen erősen expresszálódik az idegi redőkben az E8.5-nél (4B. ábra), a neurális tubusban és az E9.5-nél és az E10.5-nél (4C. és D. ábra), valamint a fejlődő végtagokban. az E10-nél.5. ábra és a szemek (4D. ábra).Korábban beszámoltunk arról, hogy a SPECC1L expresszió az első garatívben az E10.5-nél jelen volt a hámban és az alatta lévő mesenchymában18, összhangban a CNCC-vonallal.A SPECC1L expressziójának tesztelésére CNCC-ben E8.5 idegredőket (4E-J ábra) és E9.5 koponyametszeteket (4K- ábra) végeztünk.Az E8.5-nél a SPECC1L intenzíven festette az idegi redőket (4E. ábra, H), beleértve az NCC-markerekkel festett sejteket (4G. ábra, J).Az E9.5-nél a SPECC1L (4K. ábra, N) erősen megfestődött a vándorló CNCC-vel, amely együtt festődött AP2A-val (4L. ábra, M) vagy SOX10-cel (4O. ábra, P).
(A) Az egér Specc11 gén sematikus ábrázolása, amely csalivektor-inszerciót mutat ES DTM096 (1. intron) és RRH048 (15. intron) sejtklónokban.Heterozigóta Specc1lDTM096 embriók (BD) lacZ festése, amelyek Specc1l expressziót képviselnek E8.5-től E10.5-ig.NE = neuroektoderma, NF = idegi redő, PA1 = első garatív.(EP) SPECC1L immunfestés AP2A és SOX10 NCC markerekkel E8.5 (NF; EJ) idegredőkben és E9.5 (KP) koponyametszetekben.A SPECC1L festődést széles körben megfigyelték az E8.5 (E, H; nyílhegyek) idegi redőkben, beleértve az AP2A (F, G; nyílhegyek) és SOX10 (I, J; nyílhegyek) jelölt sejteket.Az E9.5-nél a SPECC1L erősen megfestődött a migráló CNCC-kben (K, N; nyilak), amelyeket AP2A (L, M; nyilak) és SOX10 (O, P; nyilak) jelöltek.
A heterozigóta Specc1lDTM096/+ és Specc1lRRH048/+ egerek keresztezése azt mutatja, hogy a két géncsapda allél nem komplementer, és hogy az összetett heterozigóták és az embrionális homozigóták bármelyik géncsapda allél esetében embrionálisan halálosak (S1. táblázat).A mendeli arányok a heterozigóták születéskori túlélési arányának csökkenését jelezték (várhatóan 1,34 vs. 2,0).Alacsony perinatális mortalitást észleltünk a heterozigóták között, néhány esetben craniofacialis anomáliák voltak (S3. ábra).Azonban ezen perinatális craniofaciális fenotípusok alacsony penetranciája megnehezíti a mögöttes patofiziológiai mechanizmusaik tanulmányozását.Ezért a homozigóta Specc11 mutánsok embrionális letális fenotípusára összpontosítottunk.
A legtöbb összetett heterozigóta vagy homozigóta Specc1lDTM096/RRH048 mutáns embrió nem fejlődött ki az E9.5–10.5 után (5A–D. ábra), és a neurális cső nem záródott elölről (5B., D. ábra), néha pedig hátul záródott (nincs ábrázolva). ..Ez a koponya idegcső záródási hibája azzal járt, hogy a DLX2 jelzésű CNCC többsége az E10.5-nél az idegredőkben maradt, ami azt jelzi, hogy nincs disszekció (5A'-D' ábra).Annak megállapítására, hogy a CNCC teljes mérete is csökkent-e, a CNCC vonalakat GFP-vel jelöltük meg a Wnt1-Cre és ROSAmTmG géncsapda vonalainkban.Egész embriókból válogatott GFP+ NCC és GFP- (RFP+) non-NCC áramolunk.Az E9.5-nél az áramlás szerint rendezett GFP-vel jelölt CNCC-k aránya nem változott szignifikánsan a WT és a mutáns embriók között (nincs ábrázolva), ami normális CNCC specifikációt jelez.Ezért azt feltételeztük, hogy a maradék Wnt1-Cre és DLX2 festődés a szabaddá vált idegi redőkben (5B' ábra) a hibás CNCC rétegződés következménye, valószínűleg az AJ sejtek megnövekedett sűrűsége vagy diszperziója miatt, amint az SPECC1L-kd sejtekben látható.A SOX10, AP2A és DLX2 NCC markereket használtuk a CNCC jelenlétének megerősítésére az idegredőben (5E-R ábra).Az E8.5-nél a WT (5E, G, I ábra) és a Specc1l mutáns (5F, H, J ábra) metszeteiben mindhárom NCC-marker neurális redős festődését figyelték meg.Az E9.5-nél, míg az NCC-markerek a vándorló NCC-t festették a WT-metszetekben (5M, O, Q ábra), maradék NCC-festődést figyeltek meg a Specc1l mutáns embriók szabaddá vált idegi redőiben (5N, P, R ábra).Mivel a SOX10 és a DLX2 migráló CNCC-ket jelöl, ez az eredmény arra utal, hogy a SPECC1L-hiányos CNCC-k elérik a migráció utáni specifikációt, de nem tudnak migrálni az idegi redőkből.
A Specc11 hiánya hibás idegcső záródáshoz, a koponya idegi gerincsejtek delaminációjához és AJ-khoz vezet.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre-vel (A') jelölt vándorló cranialis neurális crest sejteket (CNCC) hordozó embrió.Ezzel szemben a Specc11 mutáns embriók nyitott idegi ráncokat (B), nyílhegyeket és CNCC-ket mutatnak, amelyek nem vándoroltak (B', nyílhegyek).(C, D') E10.5 WT embriók (C, C') és Specc1l (D, D') DLX2 CNCC-markerének fényes mezői (C, D') és immunfestése (C', D').A WT E10.5 embriókban a DLX2-pozitív CNCC kolonizálja a kopoltyúíveket (C', nyilak), míg a mutánsokban a szembetűnő festődés a nyitott idegi redőkben (D', nyilak) és az első garatívekben (D', nyilak).) néhány festéssel (nyilak), ami a CNCC gyenge delaminációját és migrációját jelzi.ER) A WT és Specc1l mutáns embriók E8.5 (E–L) és E9.5 (M–R) stádiumú metszeteit SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) és DLX2 (I, J, Q, R).Az E8.5-nél NCC festődést figyeltek meg a vad típusú neurális redőben (NF) és a mutáns metszetekben.Az SOX10 és a β-catenin együttes festése E8.5 WT-ben (K) és mutánsban (L) fokozott β-katenin festődést mutatott ki a sejthatárokon az idegi redőkben.Az E9.5-nél a vándorló CNCC-k (M, O, Q) vad típusú festődését figyelték meg, míg a mutánsokban a rétegezetlen CNCC-k nyitott idegredőket festettek (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ jelölési elemzés WT és Specc11DTM096/RRH048 embriók koronális metszeteiben E9.5 mutációval.A jobb felső sarokban hozzávetőleges metszetsík látható.A mutáns szövetek metszeteiben az F-aktin (S, T) és a miozin IIb (U, V) fokozott festődését figyelték meg.A 3. ábrán látható in vitro eredményekhez hasonlóan mutáns embriókban a β-catenin (W, X) és E-cadherin (Y, Z) fokozott membránfestődését figyelték meg.(AA-BB) A vad típusú embrió metszetének elektronmikroszkópos felvétele, amely az apikális-bazális sejt határán túlra néz, egy jól elkülöníthető elektronsűrű régiót mutat, amely adhezív csomópontokra utal (AA, nyilak).Ezzel szemben a Specc11 mutáns embriók metszeteiben (BB, nyilak) a teljes apikobazális csomópont elektronsűrű, ami a tapadó csomópontok megnövekedett sűrűségét és diszperzióját jelzi.
Hipotézisünk tesztelésére, miszerint a csökkent rétegződés a megváltozott AJ-nek köszönhető, megvizsgáltuk az AJ jelölést Specc1l mutáns embriók szabaddá vált idegi redőiben (5S-Z ábra).Megfigyeltük az aktin stresszrostok növekedését (5S. ábra, T), és ezzel egyidejűleg a miozin IIB festődés fokozott lokalizációját az aktinrostokon (5U., V. ábra).Fontos, hogy a β-catenin (5W, X ábra) és E-cadherin (5Y, Z ábra) fokozott festődését figyeltük meg az intercelluláris határokon.Megvizsgáltuk az NCC β-catenin festődését is az E8.5 embriók idegi redőiben (5K, L ábra).A β-katenin festődés erősebbnek tűnt a Specc1l mutáns idegi redőkben (5L és K ábra), ami arra utal, hogy az AJ változások elkezdődtek.Az E9.5 embriók koponyametszeteinek elektronmikroszkópos felvételein ismét fokozott diffúz elektronsűrű festődést figyeltünk meg Specc1l mutáns embriókban a WT-hez képest (5AA, BB és S1E-H ábra).Összességében ezek az eredmények alátámasztják in vitro eredményeinket SPECC1L-kd U2OS sejtekben, és azt sugallják, hogy az aberráns AJ festődés megelőzi a CNCC rétegződést mutáns embrióinkban.
Tekintettel az AKT aktivitás és az E-cadherin stabilitás közötti ismert antagonista kapcsolatra,17,28 feltételeztük, hogy a PI3K-AKT jelátvitel szerepet játszik.Ezenkívül néhány mutáns embriónkban szubepidermális hólyagosodást figyeltünk meg, amelyek elkerülték a letalitást (<5%) az E9,5-10,5-nél, és ehelyett E13,5 körül telepedtek le (S3. ábra).A subepidermális vezikulák a PDGFRα12-n alapuló csökkent PI3K-AKT jelátvitel fémjelzi.Fantauzzo et al.(2014) arról számoltak be, hogy a PdgfraPI3K/PI3K mutáns embriók PDGFRα-alapú PI3K-aktivációjának megszakítása szubepidermális hólyagokat, idegcső-defektusokat és szájpadhasadék-fenotípusokat eredményez.Valójában a pan-AKT és az aktív foszforilált Ser473-AKT szintje in vivo csökkent a Speccl mutáns szövetekben az E9.5 embrionális leállásig (6A-D. ábra).A foszforilált Ser473-AKT szintjének csökkenése teljes mértékben a pan-AKT in vivo (6E. ábra) és in vitro (6F. ábra) csökkenése miatt következhet be.In vitro csökkenést csak akkor figyeltek meg, ha az U2OS sejtek erősen konfluensek voltak a sejtforma és az AJ sűrűség változásaival (6D ábra).Így adataink arra utalnak, hogy a SPECC1L a PI3K-AKT jelátvitel új pozitív szabályozója a craniofacialis morfogenezisben.
(A–E) E8.5 (A,B) és E9.5 (C,D) koponyametszetek vagy E9.5 lizátumok Specc1l mutáns embriókból (E), amelyek az aktív foszforilált S473-AKT és a pan-AKT fehérje redukcióját mutatják , összehasonlítva a kontroll WT-vel.A Western-blot-vizsgálatot vad típusú lizátumokon és mutáns lizátumokon azonos körülmények között végeztük.A SPECC1L-hez bemutatott képek egy blotból készültek.Ugyanezt a foltot eltávolítottuk, és újra megvizsgáltuk anti-pan-ACT és β-aktin antitestekkel.A Pan-AKT szintje az E8.5 idegredőkben (A, B) és a foszforilált S473-AKT szintje az E9.5 koponyametszetekben szignifikánsan csökkent.(F) A Pan-AKT szintek hasonlóképpen csökkentek a nagy konfluencián gyűjtött SPECC1L-kd U2OS sejtek lizátumaiban.A hibasávok három független Western blot kvantifikációból származó SEM-eket képviselnek.(GJ) A WT embriók E9.5 metszete KI67-tel és hasított kaszpáz 3-mal festett, sejtproliferációt (G, G') és csekély apoptotikus aktivitást (H, H') mutatva.A Specc11 mutáns embriók hasonló sejtproliferációt mutatnak (I), de az apoptózison átesett sejtek száma jelentősen megnő (J).
Ezután megvizsgáltuk a proliferáció és az apoptózis markereit.Nem tapasztaltunk különbséget az E9.5 embriók proliferációjában (6E. ábra, G az I-hez képest), a KI67 festéssel mért proliferációs index 82,5% volt a WT mutánsok és 86,5% a Specc1l mutánsok esetében (p <0,56, Fisher-féle pontos teszt).Hasonlóképpen, nem figyeltünk meg semmilyen különbséget az apoptózisban, amelyet a hasított kaszpáz 3 festésével mértünk az E8.5 idegi redőkben az embrió leállásáig (nincs ábrázolva) (nincs ábrázolva).Ezzel szemben az apoptózis szignifikánsan megnövekedett minden E9.5 mutáns embrióban (6F, H és J ábra).Az apoptózis ezen általános növekedése összhangban van a csökkent PI3K-AKT jelátvitellel és a korai embrionális letalitással29, 30, 31.
Ezt követően, hogy megerősítsük a PI3K-AKT jelátvitel ok-okozati szerepét a kd-sejtek AJ-változásaiban, kémiailag megváltoztattuk az útvonalat a kontroll- és a kd-sejtekben (7A-F ábra).Markerként a konfluens SPECC1L-kd sejtekben megfigyelt sejtalakváltozás fenotípust használtuk, amelyet a leghosszabb dimenzió (hossz) és a megfelelő függőleges dimenzió (szélesség) arányával határoztunk meg.A viszonylag kerek vagy kocka alakú sejteknél 1-es arány várható (7G. ábra).A sejtalak mellett β-katenin festéssel is megerősítettük az AJ-re gyakorolt ​​hatást (7A'-F' ábra).A PI3K-AKT útvonal wortmannin alkalmazásával történő gátlása elegendő volt ahhoz, hogy megváltoztassa a sejt alakját a kontrollsejtekben (7A, C ábra) és AJ (7A' ábra).Az SC-79 PI3K-AKT aktivátor nem befolyásolta a sejt alakját (7A. és E. ábra) vagy az AJ expanzióját (7A' ábra) a kontrollsejtekben.A SPECC1L-kd sejtekben a PI3K-AKT útvonal további szuppressziója fokozott apoptózist (7B. és D. ábra) és a β-katenin festődés jelentős növekedését (7B' ábra) eredményezte, összhangban in vivo nehéz mutánsainkkal.Fontos, hogy a PI3K-AKT útvonal aktiválása jelentősen javította a sejt alakját (7B, F ábra) és az AJ fenotípust (7B ábra”).A sejt alakjában bekövetkezett változásokat a sejt kerekségi arányaként (CCR) számszerűsítettük, és a szignifikancia szempontjából összehasonlítottuk a fent leírtak szerint (7G. ábra).Valójában a kontrollsejtekben (7G. ábra, CCR = 1,56) a wortmannin kezelés elegendő volt ahhoz, hogy a megfigyelthez hasonló mértékben jelentősen megváltoztassa a sejt alakját (7G. ábra, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9). SPECC1L-ben.-kd sejtek (7G. ábra, CCR = 3,46).A SPECC1L-kd sejtek wortmannin-kezelése (7G. ábra, CCR=3,60, elhanyagolható) nem volt jelentősebb, mint a kezeletlen kd-sejtek (7G. ábra, CCR=3,46, elhanyagolható) vagy a wortmanninnal kezelt kontrollsejtek (7G. ábra)., CCR = 3,46, elhanyagolható) ezenkívül befolyásolja a sejtmegnyúlást (7G, CCR = 3,61, elhanyagolható).A legfontosabb, hogy az SC-79 AKT aktivátor helyreállította a SPECC1L-kd sejtek megnyúlt fenotípusát (7G. ábra, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Ezek az eredmények megerősítik, hogy a SPECC1L szabályozza a PI3K-AKT jelátvitelt, és arra utal, hogy a SPECC1L mérsékelt csökkenése befolyásolja a sejtadhéziót, míg az erős csökkenés apoptózishoz vezet (8. ábra).
(A–F') Kontroll (A, C, E) és SPECC1L-kd (B, D, F) sejtek PI3K-AKT útvonal gátló wortmanninnal (C, D) vagy SC-79 aktivátorral (E, F) kezelt kezelés .A kezeletlen kontrollsejtek kocka alakúak (A) normál β-macska sejtfestéssel (A'), míg a kd sejtek megnyúltak (B) fokozott β-macska festődéssel (B').A PI3K-AKT útvonal elnyomása után a kontroll sejtek megnyúltak (C) β-cat expanzióval (C'), míg a kd sejtek apoptózisnak indultak (D), hasonlóan erősen mutált embrióinkhoz, és rendkívül fokozott β-cat-ot mutattak.festés (D').A PI3K-AKT útvonal aktiválása után a kontroll sejtek kocka alakúak maradtak (E) és normális β-cat (E') festődést mutattak, míg a kd sejtek szignifikánsan javult a sejtforma (F) és a β-cat (F') festődés, ami arra utal, hogy (G) A sejt alakváltozásának mértékét (AF) a leghosszabb dimenzió (hossz) és a megfelelő függőleges méret (szélesség) cella kerekségi arányának (CCR) segítségével számszerűsítettük a MetaMorph szoftver segítségével.A kezeletlen (NT) SPECC1L-kd sejtek (CCR = 3,46) szignifikánsan hosszabbak voltak, mint a kontrollsejtek (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).A kontrollsejtekben a PI3K-AKT útvonal Wort-féle gátlása elegendő volt ahhoz, hogy hasonló sejtforma megnyúlást idézzen elő (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Hasonlóképpen, az SC-79 AKT aktiválása SPECC1L-kd sejtekben visszaállította a sejtmegnyúlást a kontroll szintre (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).A SPECC1L-kd sejtek Wortmannin-kezelése fokozott apoptózist eredményezett, de a sejtalak változásának további növekedését nem (CCR=3,60) a kezeletlen kd-hez (CCR=3,46, ns) vagy a wortmanninnal kezelt kontrollsejtekhez (3,61) képest ben figyelték meg.ns = nem számít.50 sejt +/- SEM mérései láthatók.A statisztikai különbségeket Student-féle t-próbával számítottuk ki.
(A) A PI3K-AKT útvonal gátlásának és aktiválásának sematikus ábrázolása, ami AJ változásokat és mentést eredményez.(B) Az AKT fehérje SPECC1L általi stabilizálásának javasolt modellje.
A premigrációs CNCC-k AJ lízist igényelnek, hogy elkülönüljenek az elülső idegi ráncos neuroepiteliális sejtektől1, 15, 32.Az AJ komponensek fokozott festődése és az apikális-bazális AJ aszimmetrikus eloszlás elvesztése SPECC1L-hiányos sejtekben mind in vitro, mind in vivo, valamint a SPECC1L fizikai közelsége a β-kateninhez azt sugallja, hogy a SPECC1L az AJ lokális stabilitásának megfelelő fenntartása érdekében működik. szervezeti izmok.aktin citoszkeleton.A SPECC1L összefüggése az aktin citoszkeletonnal és a β-kateninnel, valamint a kondenzált aktin filamentumok számának növekedése SPECC1L hiányában összhangban van az AJ sűrűség megfigyelt növekedésével.Egy másik lehetőség az, hogy a SPECC1L-hiányos sejtekben megnövekedett aktinrostok száma az intercelluláris feszültség megváltozásához vezet.Mivel a celluláris stressz befolyásolja az AJ 33 dinamikáját, a feszültségváltozások diffúzabb AJ 34-et eredményezhetnek.Tehát minden változtatás hatással lesz a CNCC rétegekre.
A Wnt1 a korai idegi redőkben expresszálódik, amelyek idegi gerincsejteket eredményeznek.Így a Wnt1-cre vonalkövetés mind a megelőző, mind a migráló NCC35-öt jelöli.A Wnt1 azonban a korai idegi redőkből származó dorsalis agyszövet klónokat is jelöli35,36, ami valószínűsíti, hogy az E9.5 mutánsok festése a Wnt1 markerekre nyílt idegi redőkben nem CNCC.Az AP2A és SOX10 NCC markerekre vonatkozó pozitív festésünk megerősítette, hogy a Specc11 mutáns embriók feltárt idegi ráncai valóban tartalmaztak CNCC-t.Ezen túlmenően, mivel az AP2A és a SOX10 a korai migrációs NCC markerei, a pozitív festődés azt jelezte, hogy ezek a sejtek migráció utáni CNCC, amelyeket nem lehet E9.5-tel rétegezni.
Adataink arra utalnak, hogy az AJ SPECC1L általi molekuláris szabályozását a PI3K-AKT jelátvitel közvetíti.Az AKT jelátvitel csökken a SPECC1L hiányos sejtekben és szövetekben.Fantauzzo et al.támogatja a PI3K-AKT jelátvitel közvetlen szerepét a craniofaciális morfogenezisben.(2014) kimutatták, hogy a PDGFRα-alapú PI3K-AKT jelátvitel aktiválásának hiánya szájpadhasadék-fenotípushoz vezet.Azt is megmutattuk, hogy a PI3K-AKT útvonal gátlása elegendő az AJ és a sejt alakjának megváltoztatásához U2OS sejtekben.Eredményeinkkel összhangban Cain et al.37 kimutatta, hogy a PI3K α110 alegység leszabályozása az endothel sejtekben hasonló növekedést eredményez a pericelluláris β-katenin festődésben, amit a „kapcsolati index” növekedésének neveznek.Azokban az endothel sejtekben azonban, amelyek aktin filamentumai már erősen szervezettek, a PI3K-AKT útvonal elnyomása laza sejtalakot eredményez.Ezzel szemben a SPECC1L-kd U2OS sejtek megnyúlt sejtformát mutattak.Ez a különbség sejttípus-specifikus lehet.Míg a PI3K-AKT jelátvitel elnyomása tartósan befolyásolja az aktin citoszkeletont, addig a sejt alakra gyakorolt ​​hatást a központi aktin rostok sűrűségének és szerveződésének változása által okozott feszültségváltozások határozzák meg.Az U2OS sejtekben csak a sejtalak változásait használtuk a SPECC1L-hiányos AJ változás és helyreállítás markereként.Összefoglalva, feltételezzük, hogy az AKT útvonal gátlása SPECC1L-hiányban növeli az AJ stabilitását és csökkenti a delaminációt CNCC-ben.
Érdekes módon a pán-AKT szintek csökkentek in vitro és in vivo a foszforilált 473-AKT szint mellett SPECC1L hiányában, ami a PI3K-AKT jelátvitel szabályozására utal az AKT fehérje stabilitásának vagy forgalmának szintjén.Az Opitz/GBBB-szindrómához társuló SPECC1L és MID1 gének olyan fehérjéket kódolnak, amelyek stabilizálják a mikrotubulusokat18,22.A mechanizmus, amellyel a SPECC1L és a MID1 közvetíti a mikrotubulusok stabilizálását, nem teljesen ismert.A SPECC1L esetében ez a stabilizálás magában foglalja a mikrotubulusok egy részhalmazának fokozott acetilezését 18 .Lehetséges, hogy a SPECC1L hasonló mechanizmust használ más fehérjék, például az AKT stabilizálására.Kimutatták, hogy az AKT fehérjében lévő lizin-maradékok acetilezése a membrán lokalizációjának és foszforilációjának csökkenéséhez vezet38.Ezenkívül a K63 lánc ubikvitinálása az AKT-n ugyanazon lizin-maradékon szükséges a membrán lokalizációjához és aktiválásához39, 40.A SPECC1L fehérjékkel kölcsönhatásba lépő számos tényező közül, amelyeket különböző nagy áteresztőképességű élesztő két-hibrid szűréseken azonosítottak, négy – CCDC841, ECM2942, APC és UBE2I43 – szerepet játszik a fehérje forgalmában vagy stabilitásában ubikvitináción vagy szumoiláción keresztül.A SPECC1L részt vehet az AKT lizin-maradékok poszttranszlációs módosításában, ami befolyásolja az AKT stabilitását.Azonban a SPECC1L kritikus szerepe az AKT fehérje lokalizációjában és stabilitásában még tisztázásra vár.
A SPECC1L expressziójának súlyos hibái in vivo fokozott AJ marker festődést és hibás CNCC overlayt, valamint fokozott apoptózist és korai embrionális letalitást eredményeztek.Korábbi jelentések kimutatták, hogy a megnövekedett apoptózisszintű egérmutánsok idegcső-defektusokkal 44, 45, 46, 47 és craniofacialis defektusokkal járnak együtt.Feltételezték, hogy a túlzott sejthalál az idegi redőkben vagy a garatívekben a megfelelő morfogenetikai mozgáshoz szükséges sejtszám elégtelenségét eredményezheti 48,49,50.Ezzel szemben a mérsékelten csökkent SPECC1L expresszióval rendelkező SPECC1L-hiányos sejtvonalaink csak AJ-változásokat mutattak, megnövekedett sejthalál bizonyítéka nélkül.Azonban a PI3K-AKT útvonal kémiai gátlása ezekben a Kd sejtekben fokozott apoptózist eredményezett.Így a SPECC1L expressziójának vagy funkciójának mérsékelt csökkenése biztosítja a sejtek túlélését.Ez összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy ritka Specc11 mutáns embriók, amelyek elkerülik a letartóztatást a st.Az E9.5 – talán a csökkent génbefogási hatékonyság miatt – képesek lezárni idegcsövét, és később megállni a fejlődésben, gyakran koponya-archibákkal (S3. ábra).Ezzel összhangban áll a heterozigóta Specc1l embriók ritka előfordulása craniofacialis rendellenességekkel – valószínűleg a megnövekedett génbefogási hatékonyság miatt –, valamint a zebradániában a két SPECC1L ortológ egyike (specc1lb) késői embrionális fenotípusokat okoz, beleértve az embrió elvesztését is. alsó állkapcsok és kétoldali hasadékok51.Így az emberi betegekben azonosított heterozigóta SPECC1L funkcióvesztési mutációk kis mértékű károsodást okozhatnak a SPECC1L funkcióban a craniofacialis morfogenezis során, ami elegendő az orofaciális hasadékok magyarázatához.Az intercelluláris kontaktusok SPECC1L-alapú szabályozása szintén szerepet játszhat a palatogenezisben és a garatívek összeolvadásában.A SPECC1L funkció további vizsgálatai segítenek feltárni az ideiglenes intercelluláris kontaktusok szerepét a CNCC-ben az idegcső záródása során a neuroepiteliális sejtek mozgékonyságában és a craniofacialis morfogenezisben.
Az U2OS osteosarcoma kontrollt és a SPECC1L-kd sejteket korábban leírták (Saadi et al., 2011).A SPECC1L elleni antitesteket korábban is jellemezték (Saadi et al., 2011).Anti-β-katenin antitestek (nyúl; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (egér; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miozin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), hasított kaszpáz 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) és β-aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) a leírtak szerint alkalmaztuk..Az aktin filamentumokat Acti-festett rodamin falloidinnel (Cytoskeleton, Denver, Colorado) festettük.
Az U2OS kontrollsejteket és a SPECC1L-kd sejteket standard magas glükóz tartalmú DMEM-ben tenyésztettük, kiegészítve 10% magzati szarvasmarha szérummal (Life Technologies, Carlsbad, CA).Az AJ változásokhoz 2 x 105 sejtet oltottunk 0,1%-os sertészselatinnal kezelt üvegre (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), és megfigyeltük a sejtalak változásait.A sejteket különböző jelzett időpontokban gyűjtöttük össze: 4 órával az oltás után (t = 1), 24 órával az oltás után (t = 2), összefolyás a sejt alakjának változása nélkül (t = 3), sejt alakváltozás (t = 4) , 24 órával a sejtalak változása után (t = 5) és 48 órával a sejtalak változása után (t = 6) (1., 2., 3. ábra).A PI3K-AKT útvonal modulálására a sejteket a jelzett koncentrációkban tenyésztettük a PI3K-AKT inhibitor wortmanninnal (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) vagy SC-79 aktivátorral (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).A vegyszereket tartalmazó táptalajt naponta cseréltük.
Frame-by-frame felvételeket készítettünk élő kontroll- és KD-sejteken normál tenyésztési körülmények között, és fáziskontrasztos képeket gyűjtöttünk 10 percenként 7 napon keresztül.A képeket egy számítógép által vezérelt Leica DM IRB fordított mikroszkóp segítségével készítettük, amely mechanikus tárgyasztallal és 10 × N-PLAN objektívvel volt csatlakoztatva egy QImaging Retiga-SRV kamerához.A képalkotás során a sejttenyészeteket 37 °C-on tartottuk nedves, 5% CO2-tartalmú atmoszférában.
A Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) két géncsapda ES sejtvonalát, a DTM096-ot és RRH048-at használtuk a Specc11-hiányos egérvonalak létrehozására, amelyeket Specc1lgtDTM096-nak és Specc1lgtRRH046-nak neveztek.Röviden, 129/REJ ES sejteket injektáltunk C57BL6 blasztocisztákba.Az eredményül kapott kiméra hím egereket nőstény C57BL6 egerekkel tenyésztettük, hogy azonosítsuk az agouti szőrzet színezetű utódokat.A heterozigóták azonosítására géncsapda vektor inszertek jelenlétét használtuk.Az egereket 129/REJ;C57BL6 vegyes háttéren tartottuk.A genetikai csapdavektor inszerciós helyének helyét RT-PCR, genomszekvenálás és genetikai komplementáció igazolta (1. kiegészítő ábra).A kettős heterozigóta Specc1lGT egerek CNCC-vonalának nyomon követésére a ROSAmTmG (#007576) és Wnt1-Cre (#003829) egereket (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) kereszteztük, hogy a Speccosl emblémában ROSAmTmG és Wnt1-Cre mutációt kapjunk.Az egereken végzett összes kísérletet a Kansas Egyetem Orvosi Központjának Institutional Animal Care and Use Committee által jóváhagyott protokollok szerint végeztük.
Az embriókat 60 percig szobahőmérsékleten rögzítettük (1% formaldehid, 0,2% glutáraldehid, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA).X-gal festőoldatban (5 mM kálium-ferricianid, 5 mM kálium-ferrocianid, 2 mM MgCl2, 0,01% nátrium-dezoxikolát, 0,02% nátrium-dezoxikolát, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) történő fixálás után 37 °C-on végeztük a foltok kifejlődését. .°C 1-6 órán belül.Az embriókat utólag fixáltuk 4%-os PFA-ban, és láthatóvá tettük.
A Western-blothoz a sejteket passzív lízispufferben (Promega, Fitchburg, WI) lizáltuk HALT proteáz inhibitorok keverékével (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).A lizátumokat 12%-os poliakrilamid Mini-PROTEAN TGX kész géleken (Bio-Rad, Hercules, CA) dolgoztuk fel, és Immobilon PVDF membránokra vittük át (EMD Millipore, Billerica, MA).A membránokat 0,1% Tween-t tartalmazó 5%-os tejben blokkoltuk.Az antitesteket egy éjszakán át 4 °C-on vagy egy órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk.A jelgeneráláshoz Femto SuperSignal West ECL reagenst (Thermo Scientific, Waltham, MA) használtunk.Az immunfestéshez az embriókat egy éjszakán át fixáltuk 4% PFA/PBS-ben, és mélyhűtöttük.A szöveti krioszekciókat 1% normál kecskeszérumot (Thermo Scientific, Waltham, MA) és 0,1% Triton X-100-at (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tartalmazó PBS-ben blokkoltuk, majd 4 °C-on inkubátorban inkubáltuk. éjszaka.anti-antitesttel és fluoreszcens másodlagos antitesttel (1:1000) 1 órán át 4 °C-on.A festett metszeteket ProLong arany tápközegbe (Thermo Scientific, Waltham MA) helyeztük, és lapos képeket készítettünk Leica TCS SPE konfokális mikroszkóp segítségével.Mindegyik immunfestést három független kísérletként hajtották végre legalább két mutáns embrió cirossectioján.Egy reprezentatív kísérlet látható.
A sejteket módosított RIPA pufferben (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glicerin, 2 mM EDTA és HALT proteáz inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) inkubáltuk. Röviden, a lizátumokat protein G mágneses gyöngyökkel (Life Technologies, Carlsbad, CA) előtisztítottuk, majd egy éjszakán át 4 °C-on anti-SPECC1L vagy IgG protein G fehérjegyöngyökkel inkubáltuk. A fent leírt -β-katenin antitest A bemutatott ko-IP kísérletek négy független kísérletet reprezentálnak.
Rögzített tenyésztett sejteket vagy egérembrionális szöveteket a Kansas Egyetem Orvosi Központjának elektronmikroszkópos központjába szállítottak.Röviden, a mintákat EMbed 812 gyantába ágyaztuk (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), egy éjszakán át polimerizáltuk 60 °C-on, és 80 nm-en metszettek egy gyémántpengével felszerelt Leica UC7 ultramikrotómmal.A metszeteket JEOL JEM-1400 transzmissziós elektronmikroszkóppal tettük láthatóvá, amely 100 kV-os Lab6 pisztollyal volt felszerelve.
Hogyan idézzük ezt a cikket: Wilson, NR et al.A SPECC1L hiánya az összeillesztett ízületek megnövekedett stabilitásához és a koponya idegi gerincsejtek delaminációjának csökkenéséhez vezet.a tudomány.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Az idegi taréj indukciója és differenciálódása.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.A koponya idegi gerincsejtek mozgásban: szerepük a craniofacialis fejlődésében.American Journal of Medical Genetics.A rész 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: növekedése és fejlődése 20 év alatt.Gyermekorvos.patológia.laboratórium.gyógyszer.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU és Noten MM Áttörés az orofaciális hasadékok genetikájában.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. és Riley, FM Molekuláris mechanizmusok koponya neurális taréjsejtek migrációja és mintázata során craniofacialis fejlődés.Development 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH és Murray, JK. Ajak- és szájpadhasadék: a genetikai és környezeti hatások megértése.természetes megjegyzés.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.A bőr, a végtagok és a craniofacialis régió kóros morfogenezise interferon-szabályozó faktor-6 (Irf6)-hiányos egerekben.National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.A GRHL3 domináns mutációi van der Waord szindrómát okoznak, és károsítják a szájüreg fejlődését.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ és Juriloff, DM Frissítse azon egérmutánsok listáját, amelyek hibás a neurális csőzáródásban, és haladjanak tovább az idegcsőzáródás teljes genetikai megértése felé.A születési rendellenességek vizsgálata.A rész, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. A PI3K által közvetített PDGFRalpha jelátvitel szabályozza a túlélést és a proliferációt a csontváz fejlődésében egy p53-függő intracelluláris útvonalon keresztül.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND és Murdoch, JN Disheveled: A konvergens expanzió kapcsolata az idegcső zárásával.Trendek a neurológiában.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).